{"id":9537,"date":"2026-10-20T15:11:06","date_gmt":"2026-10-20T14:11:06","guid":{"rendered":"https:\/\/wheat-quail-856400.hostingersite.com\/pbmc-isolation-protocol\/"},"modified":"2026-10-26T15:03:17","modified_gmt":"2026-10-26T14:03:17","slug":"pbmc-isolierung-protokoll","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/seamlessbio.de\/de\/pbmc-isolation-protocol\/","title":{"rendered":"Protokoll zur PBMC-Isolierung: Dichtegradientenzentrifugation mit einem Lymphozyten-Separationsmedium"},"content":{"rendered":"<div data-elementor-type=\"wp-post\" data-elementor-id=\"9537\" class=\"elementor elementor-9537\" data-elementor-post-type=\"post\">\n\t\t\t\t<div class=\"elementor-element elementor-element-be28d58 e-flex e-con-boxed e-con e-parent\" data-id=\"be28d58\" data-element_type=\"container\" data-e-type=\"container\">\n\t\t\t\t\t<div class=\"e-con-inner\">\n\t\t\t\t<div class=\"elementor-element elementor-element-618e9869 elementor-widget elementor-widget-text-editor\" data-id=\"618e9869\" data-element_type=\"widget\" data-e-type=\"widget\" data-widget_type=\"text-editor.default\">\n\t\t\t\t\t\t\t\t\t<p>Mononukle\u00e4re Zellen des peripheren Blutes (PBMC) \u2013 Lymphozyten und Monozyten \u2013 sind das Ausgangsmaterial f\u00fcr Immunph\u00e4notypisierung, T-Zell-Assays, ELISpot, Zytokinfreisetzungs-Assays und viele Zelltherapie-Workflows. Am h\u00e4ufigsten werden sie per Dichtegradientenzentrifugation \u00fcber ein Lymphozyten-Separationsmedium mit 1,077 g\/ml isoliert.<\/p>\n<p>Dieses Protokoll beschreibt das Standardverfahren f\u00fcr frisches, antikoaguliertes humanes Vollblut mit <a href=\"\/de\/produkt\/lymphobio-pbmc-isolation-density-1-077-g-ml-ficoll-alternative-sterile-filtered\/\">Lymphobio, einer gebrauchsfertigen Lymphozyten-Separationsl\u00f6sung mit 1,077 g\/ml<\/a>.<\/p>\n<h2>So funktioniert die Dichtegradiententrennung<\/h2>\n<p>Das Separationsmedium ist eine L\u00f6sung auf Polysaccharose-Basis, eingestellt auf eine Dichte von 1,077 g\/ml bei 20 \u00b0C. Bei der Zentrifugation:<\/p>\n<ul>\n<li><strong>Erythrozyten und Granulozyten<\/strong> sind dichter als 1,077 g\/ml. Sie sedimentieren durch das Medium auf den Boden des R\u00f6hrchens. Erythrozyten aggregieren im Medium, was ihre Sedimentation beschleunigt.<\/li>\n<li><strong>Mononukle\u00e4re Zellen<\/strong> (Lymphozyten, Monozyten) sind weniger dicht. Sie sammeln sich als wei\u00dfliche Bande an der Grenzfl\u00e4che zwischen Plasma und Medium.<\/li>\n<li><strong>Plasma und die meisten Thrombozyten<\/strong> bleiben in der oberen Schicht.<\/li>\n<\/ul>\n<p>Die Methode h\u00e4ngt von korrekter Dichte, Temperatur und einem ungest\u00f6rten Gradienten ab. Die meisten misslungenen Isolierungen gehen auf einen dieser drei Punkte zur\u00fcck.<\/p>\n<h2>Material<\/h2>\n<ul>\n<li>Frisches humanes Vollblut mit Antikoagulans (EDTA, Natriumheparin oder Citrat)<\/li>\n<li><a href=\"\/de\/produkt\/lymphobio-pbmc-isolation-density-1-077-g-ml-ficoll-alternative-sterile-filtered\/\">Lymphobio Lymphozyten-Separationsl\u00f6sung, 1,077 g\/ml<\/a>, auf 18\u201320 \u00b0C temperiert<\/li>\n<li>Steriles PBS ohne Ca\u00b2\u207a\/Mg\u00b2\u207a (zum Waschen optional mit 2 mM EDTA und\/oder 0,5\u20132 % Serum oder Albumin)<\/li>\n<li>Sterile konische 15-ml- oder 50-ml-R\u00f6hrchen, serologische Pipetten, Pasteurpipetten<\/li>\n<li>Zentrifuge mit Ausschwingrotor, Temperaturregelung und abschaltbarer Bremse<\/li>\n<li>Trypanblau und ein Zellz\u00e4hler oder eine Z\u00e4hlkammer<\/li>\n<li>Sicherheitswerkbank (Klasse II) und geeignete PSA<\/li>\n<\/ul>\n<p><strong>Biosicherheit:<\/strong> Behandeln Sie jedes Humanblut als potenziell infekti\u00f6s und arbeiten Sie nach den Regeln Ihrer Einrichtung unter BSL-2-Bedingungen.<\/p>\n<h2>Schritt-f\u00fcr-Schritt-Anleitung<\/h2>\n<h3>1. Reagenzien vorbereiten<\/h3>\n<ol>\n<li>Separationsmedium, PBS und Blut auf Raumtemperatur (18\u201320 \u00b0C) bringen. Die Dichte des Mediums ist bei 20 \u00b0C spezifiziert. K\u00e4lteres oder w\u00e4rmeres Medium ver\u00e4ndert die Trennung.<\/li>\n<li>Das Separationsmedium durch vorsichtiges Schwenken der Flasche mischen. Aseptisch arbeiten.<\/li>\n<\/ol>\n<h3>2. Blut verd\u00fcnnen<\/h3>\n<ol start=\"3\">\n<li>Das Blut 1:1 mit PBS verd\u00fcnnen (z. B. 15 ml Blut + 15 ml PBS) und vorsichtig mischen. Die Verd\u00fcnnung verringert Zellaggregation und den Einschluss von Lymphozyten im Erythrozytenpellet.<\/li>\n<\/ol>\n<h3>3. Blut auf das Medium schichten<\/h3>\n<ol start=\"4\">\n<li>Separationsmedium in ein konisches R\u00f6hrchen geben:<ul>\n<li><strong>50-ml-R\u00f6hrchen:<\/strong> 15 ml Medium<\/li>\n<li><strong>15-ml-R\u00f6hrchen:<\/strong> 3\u20134 ml Medium<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li>\n<p>Das R\u00f6hrchen schr\u00e4g halten und das verd\u00fcnnte Blut langsam auf das Medium schichten. An der R\u00f6hrchenwand herunterlaufen lassen, damit sich die beiden Phasen nicht mischen:<\/p>\n<ul>\n<li><strong>50-ml-R\u00f6hrchen:<\/strong> bis zu 30\u201335 ml verd\u00fcnntes Blut<\/li>\n<li><strong>15-ml-R\u00f6hrchen:<\/strong> bis zu 8 ml verd\u00fcnntes Blut<\/li>\n<\/ul>\n<p>Eine scharfe Grenze zwischen der roten Schicht und dem klaren Medium sollte sichtbar bleiben.<\/p>\n<\/li>\n<\/ol>\n<h3>4. Zentrifugieren<\/h3>\n<ol start=\"6\">\n<li>Zentrifugieren bei <strong>400 \u00d7 g f\u00fcr 30\u201340 Minuten bei 18\u201320 \u00b0C<\/strong> im Ausschwingrotor.<ul>\n<li>Beschleunigung: niedrig<\/li>\n<li><strong>Bremse: aus.<\/strong> Eine Bremse st\u00f6rt die Grenzfl\u00e4che und vermischt die Schichten.<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ol>\n<h3>5. PBMC-Schicht ernten<\/h3>\n<ol start=\"7\">\n<li>Nach der Zentrifugation sehen Sie von oben nach unten:<ul>\n<li>Plasma<\/li>\n<li>eine wei\u00dfliche, tr\u00fcbe PBMC-Bande<\/li>\n<li>klares Separationsmedium<\/li>\n<li>ein rotes Pellet aus Erythrozyten und Granulozyten<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<li>Einen Teil der oberen Plasmaschicht mit einer Pipette abnehmen, ohne die PBMC-Bande zu ber\u00fchren. Wenn Sie autologes Plasma ben\u00f6tigen, aufbewahren.<\/li>\n<li>Die PBMC-Bande mit einer sterilen Pasteurpipette abnehmen und in ein neues R\u00f6hrchen \u00fcberf\u00fchren. M\u00f6glichst wenig Separationsmedium mitnehmen \u2013 Restmedium senkt die Viabilit\u00e4t und macht das Waschen weniger effektiv.<\/li>\n<\/ol>\n<h3>6. Zellen waschen<\/h3>\n<ol start=\"10\">\n<li>Mindestens das 3-fache Volumen PBS zu den geernteten Zellen geben (z. B. im 50-ml-R\u00f6hrchen auf 40\u201350 ml auff\u00fcllen) und vorsichtig mischen.<\/li>\n<li>Zentrifugieren bei <strong>300 \u00d7 g f\u00fcr 10 Minuten<\/strong> bei Raumtemperatur, Bremse an. \u00dcberstand verwerfen.<\/li>\n<li>Pellet in PBS resuspendieren und erneut zentrifugieren bei <strong>200 \u00d7 g f\u00fcr 10\u201315 Minuten<\/strong>. Die niedrigere Drehzahl entfernt die meisten verbliebenen Thrombozyten mit dem \u00dcberstand.<\/li>\n<li>Optional: Ist das Pellet sichtbar rot, eine kurze Erythrozytenlyse mit einem Ammoniumchlorid-Puffer durchf\u00fchren und noch einmal waschen.<\/li>\n<\/ol>\n<h3>7. Z\u00e4hlen und Viabilit\u00e4t bestimmen<\/h3>\n<ol start=\"14\">\n<li>Die Zellen in Kulturmedium oder Puffer resuspendieren und mit Trypanblau z\u00e4hlen.<ul>\n<li><strong>Viabilit\u00e4t:<\/strong> bei frischem Blut gesunder Spender typischerweise \u00fcber 90\u201395 %.<\/li>\n<li><strong>Ausbeute:<\/strong> typischerweise 0,5\u20132 \u00d7 10\u2076 PBMC pro ml Vollblut \u2013 abh\u00e4ngig von Spender, Antikoagulans und Zeit bis zur Verarbeitung.<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ol>\n<h3>8. Verwenden oder kryokonservieren<\/h3>\n<ol start=\"15\">\n<li>Die Zellen sofort verwenden oder kryokonservieren:<ul>\n<li><strong>Einfriermedium:<\/strong> 90 % Serum mit 10 % DMSO. F\u00fcr Workflows ohne bovines Material verwenden Sie <a href=\"\/de\/humanserum\/\">Humanserum<\/a> oder <a href=\"\/de\/humanserum-typ-ab\/\">humanes AB-Serum<\/a> statt FKS.<\/li>\n<li><strong>Einfrieren:<\/strong> langsam, mit etwa \u22121 \u00b0C\/min.<\/li>\n<li><strong>Lagerung:<\/strong> in der Dampfphase von fl\u00fcssigem Stickstoff.<\/li>\n<\/ul>\n<\/li>\n<\/ol>\n<h2>Kultur nach der Isolierung<\/h2>\n<p>F\u00fcr T-Zell-, NK-Zell- und Monozytenassays verwenden viele Labore Humanserum statt FKS. Das vermeidet eine xenogene Hintergrundstimulation.<\/p>\n<ul>\n<li><strong>AB-Serum:<\/strong> Serum vom Typ AB enth\u00e4lt keine Anti-A- oder Anti-B-Isoagglutinine und kann mit Zellen von Spendern jeder Blutgruppe verwendet werden. Siehe <a href=\"\/de\/human-serum-pbmc-immunoassays-ab-type\/\">Humanserum f\u00fcr PBMC und Immunoassays<\/a> und die <a href=\"\/de\/pbmc\/\">Anwendungsseite PBMC &amp; Immunologie<\/a>.<\/li>\n<li><strong>Hitzeinaktiviertes Serum:<\/strong> Wenn Komplementaktivit\u00e4t Ihren Assay st\u00f6ren w\u00fcrde, verwenden Sie <a href=\"\/de\/produkt\/human-serum-heat-inactivated-mixed-donors-eu-us-origin-sterile-filtered\/\">hitzeinaktiviertes Humanserum<\/a>.<\/li>\n<\/ul>\n<h2>Fehlerbehebung<\/h2>\n<table>\n<thead>\n<tr>\n<th>Problem<\/th>\n<th>Wahrscheinliche Ursache<\/th>\n<th>Was tun<\/th>\n<\/tr>\n<\/thead>\n<tbody>\n<tr>\n<td>Keine klare PBMC-Bande<\/td>\n<td>Blut und Medium beim \u00dcberschichten vermischt; Bremse war an<\/td>\n<td>Langsamer \u00fcberschichten; Bremse ausschalten<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Viele Erythrozyten in der PBMC-Fraktion<\/td>\n<td>Medium oder Blut zu kalt; zu viel Blut f\u00fcr das Mediumvolumen<\/td>\n<td>Bei 18\u201320 \u00b0C arbeiten; Volumenverh\u00e4ltnis einhalten; optional Erythrozytenlyse<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Kontamination mit Granulozyten<\/td>\n<td>Blut vor der Verarbeitung zu lange gelagert oder gek\u00fchlt<\/td>\n<td>Blut so schnell wie m\u00f6glich verarbeiten, idealerweise innerhalb von 8 h, bei Raumtemperatur<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Geringe Ausbeute<\/td>\n<td>Blut nicht verd\u00fcnnt; Bande nur teilweise geerntet; zu viel Medium mitgenommen<\/td>\n<td>1:1 verd\u00fcnnen; die gesamte Grenzfl\u00e4che ernten; gr\u00fcndlich waschen<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Hohe Thrombozytenzahl<\/td>\n<td>Nur mit zu hoher Drehzahl gewaschen<\/td>\n<td>Waschschritt bei 200 \u00d7 g einbauen<\/td>\n<\/tr>\n<tr>\n<td>Geringe Viabilit\u00e4t<\/td>\n<td>Lange Zeit bis zur Verarbeitung; Restmedium; grobes Pipettieren<\/td>\n<td>Verarbeitungszeit verk\u00fcrzen; Medium durch Waschen entfernen; vorsichtig pipettieren<\/td>\n<\/tr>\n<\/tbody>\n<\/table>\n<h2>Varianten<\/h2>\n<ul>\n<li><strong>Buffy Coats und Leukaphereseprodukte<\/strong> enthalten deutlich mehr Zellen pro ml. Vor dem \u00dcberschichten st\u00e4rker verd\u00fcnnen (oft 1:2 bis 1:4 mit PBS), damit der Gradient nicht \u00fcberladen wird.<\/li>\n<li><strong>Separationsr\u00f6hrchen mit por\u00f6sem Einsatz<\/strong> erlauben die Blutzugabe ohne vorsichtiges \u00dcberschichten. Befolgen Sie die Herstellerangaben zu Volumina, Drehzahl und Bremseinstellung.<\/li>\n<li><strong>Andere Spezies:<\/strong> 1,077 g\/ml ist f\u00fcr humane Zellen optimiert. Maus und einige andere Spezies ben\u00f6tigen eine andere Dichte.<\/li>\n<\/ul>\n<h2>H\u00e4ufig gestellte Fragen<\/h2>\n<p><strong>Welche Dichte sollte ein Lymphozyten-Separationsmedium f\u00fcr humane PBMC haben?<\/strong>\n1,077 g\/ml bei 20 \u00b0C. Das ist die Standarddichte zur Trennung humaner mononukle\u00e4rer Zellen von Granulozyten und Erythrozyten.<\/p>\n<p><strong>Sind Dichtegradientenmedien auf Polysucrose-Basis austauschbar?<\/strong>\nDichtegradientenmedien auf Polysucrose-Basis mit 1,077 g\/ml beruhen alle auf demselben Prinzip und demselben Protokoll. <a href=\"\/de\/produkt\/lymphobio-pbmc-isolation-density-1-077-g-ml-ficoll-alternative-sterile-filtered\/\">Lymphobio<\/a> ist als direkter Ersatz in bestehenden Protokollen ausgelegt.<\/p>\n<p><strong>Warum muss die Zentrifugenbremse aus sein?<\/strong>\nDas Abbremsen des Rotors wirbelt die Grenzfl\u00e4che auf. Die PBMC-Bande vermischt sich dann mit Medium und Erythrozyten, Ausbeute und Reinheit sinken.<\/p>\n<p><strong>Welches Antikoagulans eignet sich am besten f\u00fcr die PBMC-Isolierung?<\/strong>\nEDTA, Heparin und Citrat funktionieren alle. W\u00e4hlen Sie nach dem nachfolgenden Assay. Heparin kann zum Beispiel manche PCR-basierten Methoden st\u00f6ren. EDTA-Blut ist in der Durchflusszytometrie \u00fcblich.<\/p>\n<p><strong>Wie lange kann Blut vor der PBMC-Isolierung gelagert werden?<\/strong>\nSo schnell wie m\u00f6glich verarbeiten, idealerweise innerhalb weniger Stunden bei Raumtemperatur. Bei l\u00e4ngerer Lagerung \u00e4ndern Granulozyten ihre Dichte und kontaminieren die PBMC-Fraktion, und die Viabilit\u00e4t sinkt.<\/p>\n<p><strong>Kann ich PBMC in Humanserum statt FKS einfrieren?<\/strong>\nJa. Viele Immunologielabore verwenden Humanserum oder humanes AB-Serum mit 10 % DMSO, um bovine Proteine in sp\u00e4teren Assays zu vermeiden.<\/p>\n<h2>Lymphobio bestellen<\/h2>\n<p><a href=\"\/de\/produkt\/lymphobio-pbmc-isolation-density-1-077-g-ml-ficoll-alternative-sterile-filtered\/\">Lymphobio<\/a> ist in 100 ml und 500 ml erh\u00e4ltlich, Bulk-Volumina auf Anfrage. Jede Charge wird mit einem CoA inklusive Dichte, Osmolalit\u00e4t, Endotoxin und Sterilit\u00e4t geliefert. Preise und Verf\u00fcgbarkeit auf Anfrage \u2013 <a href=\"\/de\/request-quote\/\">Angebot anfordern<\/a>.<\/p>\n<p><strong>Verwandte Themen:<\/strong> <a href=\"\/de\/pbmc\/\">PBMC &amp; Immunologie<\/a> \u00b7 <a href=\"\/de\/humanserum-typ-ab\/\">Humanserum Typ AB<\/a> \u00b7 <a href=\"\/de\/human-serum-pbmc-immunoassays-ab-type\/\">Humanserum f\u00fcr PBMC &amp; Immunoassays<\/a> \u00b7 <a href=\"\/de\/separation-solution\/\">L\u00f6sungen f\u00fcr Zelldissoziation &amp; -separation<\/a><\/p>\t\t\t\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>\n\t\t\t\t<\/div>","protected":false},"excerpt":{"rendered":"<p>Schritt-f\u00fcr-Schritt-Isolierung von PBMC aus Vollblut mit einem Lymphozyten-Separationsmedium (1,077 g\/ml): Verd\u00fcnnung, \u00dcberschichtung, Zentrifugation bei 400 \u00d7 g, Waschen und Fehlerbehebung.<\/p>","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_templately_pack_id":"","_templately_imported_at":"","_templately_source":"","_templately_import_session_id":"","footnotes":""},"categories":[258],"tags":[],"class_list":["post-9537","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-protocols"],"yoast_head":"<!-- This site is optimized with the Yoast SEO plugin v28.7 - 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