Migrations-Scratch-Assay – Vollständiges Protokoll und Leitfaden zur Optimierung
Alles, was Sie für die Durchführung eines reproduzierbaren Wundheilungsassays benötigen: Schritt-für-Schritt-Protokoll, Serumstrategie, häufige Fallstricke und automatisierte Quantifizierung mittels Live-Zell-Imaging.
Was ist ein Migrations-Scratch-Assay? Der Scratch-Assay (Wundheilungsassay) ist eine In-vitro-Methode zur Messung der kollektiven Zellmigration. Mit einer Pipettenspitze wird in eine konfluente Monoschicht eine definierte Lücke eingebracht. Es werden Bilder zum Zeitpunkt T=0 und in regelmäßigen Abständen bis zum Wundverschluss aufgenommen. Die Geschwindigkeit des Spaltverschlusses quantifiziert die Migrationsfähigkeit unter den jeweiligen Versuchsbedingungen – diese Methode wird routinemäßig in der Krebsforschung, der Wirkstoffforschung, der Wundbiologie und bei der Prüfung von Biomaterialien eingesetzt.
Inhaltsverzeichnis
1. Prinzip und Anwendungen des Assays
Der In-vitro-Scratch-Assay – auch Wundheilungsassay genannt – simuliert die kollektive Zellmigration, indem eine zellfreie Zone in eine konfluente Monoschicht eingebracht wird. Die Zellen an der Vorderkante nehmen den offenen Raum wahr und wandern nach innen, angetrieben durch die Reorganisation des Zytoskeletts und Zell-Zell-Signale. Die Geschwindigkeit des Lückenschlusses ist ein direkter Indikator für die Migrationsfähigkeit unter definierten Bedingungen.
Der Assay wird insbesondere wegen seiner Einfachheit, seiner geringen Kosten und seiner Kompatibilität mit Standard-Multwell-Platten und Live-Cell-Imaging-Systemen geschätzt. Im Gegensatz zu Transwell-Assays (Boyden-Kammern) – bei denen die chemotaktische Migration durch eine Membran gemessen wird – erfasst der Scratch-Assay kollektive seitliche Bewegung, wodurch es die Migration von Epithelschichten bei der Wundheilung und der Tumorinvasion besser widerspiegelt.
Wichtigste Anwendungsbereiche
- Krebsbiologie: Messung der Auswirkungen von Onkogenen, siRNA-Knockdowns oder Wirkstoffkandidaten auf das Migrations- und Invasionspotenzial von Tumorzellen
- Wirkstoffforschung und -screening: Hochdurchsatz-Screening von Substanzen, die die Migration hemmen, von Kinase-Inhibitoren und von Zytokinmodulatoren
- Forschung zur Wundheilung: Untersuchung der Reaktionen von Keratinozyten und Fibroblasten auf Wachstumsfaktoren, Biomaterialien oder therapeutische Peptide
- Zellbiologie: Charakterisierung der Aktin-Dynamik, des Umsatzes fokaler Adhäsionen und der EMT (epitheliale-mesenchymale Transition)
- Prüfung von Biomaterialien: Bewertung der Biokompatibilität von Gerüsten oder Beschichtungen anhand des Zellmigrationsverhaltens
Häufig verwendete Zelllinien: HeLa, A549, MCF-7, MDA-MB-231, HCT116, HUVEC, HEKa, NIH 3T3, Vero, CHO – sowie Primärzellen, darunter Keratinozyten, Fibroblasten und Endothelzellen.
2. Schritt-für-Schritt-Anleitung
Zellen bis zur Konfluenz ausplattieren
Die Zellen in 6-Well- oder 24-Well-Platten in einer Dichte aussäen, die innerhalb von 24 Stunden eine Konfluenz von 90–100% erreicht. Für die meisten adhärenten Krebszelllinien (HeLa, A549, MCF-7): 2–4 × 10⁵ Zellen/Well in einer 6-Well-Platte. Kultivieren Sie die Zellen in Standard-Wachstumsmedium mit 10% FBS, bis sich eine dichte Monoschicht gebildet hat.
Serumentzug (optional, wird jedoch empfohlen)
Ersetzen Sie das Medium 16–24 Stunden vor dem „Scratching“ durch serumfreies oder serumarmes (0,5–1% FBS) Medium. Dies synchronisiert den Zellzyklus und hemmt die Proliferation, wodurch sichergestellt wird, dass der Spaltverschluss Migration anstatt einer Kombination aus Migration und Proliferation. Lassen Sie den Schritt „Starvation“ nur dann weg, wenn Ihre spezifische Zelllinie den Serumentzug nicht verträgt.
Den Kratzer vorstellen
Verwenden Sie eine sterile 200-µL-Pipettenspitze, die senkrecht (90°) zur Oberfläche der Vertiefung gehalten wird. Üben Sie gleichmäßigen, sanften Druck aus und ziehen Sie in einer einzigen, kontinuierlichen Bewegung eine gerade Linie quer durch die Mitte der Monoschicht. Waschen Sie die Vertiefungen sofort zweimal mit PBS, um abgelöste Zellen und Rückstände zu entfernen. Markieren Sie die Unterseite der Platte an beiden Enden des Kratzers mit einem Permanentmarker als Positionsreferenz.
Bild bei T=0 aufnehmen
Nehmen Sie unmittelbar nach dem Waschen von jeder Vertiefung ein Bild auf. Bei manueller Mikroskopie: Nehmen Sie 3–5 aufeinanderfolgende Bilder entlang der Kratzerlänge bei 4-facher oder 10-facher Vergrößerung auf, wobei mindestens 70% des Kratzers abgedeckt sein müssen. Für die automatisierte Live-Zell-Bildgebung: Legen Sie die Bildgebungsposition fest und richten Sie ein Zeitrafferprotokoll ein (empfohlenes Intervall: 30 min bis 2 h, abhängig von der Motilität der Zelllinie).
Behandlungsmedium hinzufügen und inkubieren
Ersetzen Sie das Medium durch ein Assay-Medium, das Ihre Testverbindung, Ihren Inhibitor oder Ihren Wachstumsfaktor in der gewünschten Konzentration enthält. Verwenden Sie ein Medium mit niedrigem Serumgehalt (1–2% FBS), um die Proliferation zu minimieren, es sei denn, Ihr Experiment erfordert ausdrücklich die Signalübertragung durch Wachstumsfaktoren aus dem Serum. Inkubieren Sie bei 37 °C und 5% CO₂.
Zeitpunktbilder aufnehmen und den Wundverschluss berechnen
Nehmen Sie in festgelegten Zeitabständen (in der Regel 0, 6, 12, 24 h) Aufnahmen an denselben Positionen auf. Berechnen Sie den prozentualen Wundverschluss: %-Schluss = [(Fläche T0 − Fläche Tₙ) / Fläche T0] × 100. Für die automatisierte Quantifizierung verwenden Sie die integrierte Live-Cell-Imager-Software oder ImageJ mit dem Makro „MRI Wound Healing“.
3. Wichtige Parameter und häufige Fehler
Die häufigsten Ausfallarten
| Problem | Ursache | Lösung |
|---|---|---|
| Uneinheitliche Kratzerbreite | Variabler Pipettierwinkel oder -druck | Verwenden Sie handelsübliche Ritzschablonen oder Werkzeuge zur Herstellung von 96-Well-Vertiefungen; halten Sie die Spitze stets im 90°-Winkel. |
| Die Wunde schließt sich zu schnell (<12 h) | Serumreiche oder hochmotile Zelllinie | FBS auf 0,5–1% reduzieren; Mitomycin C (10 µg/ml, 2 h) hinzufügen, um die Proliferation zu hemmen |
| Die Wunde schließt sich nicht | Zellen, die durch Hunger oder Kratzer beschädigt wurden | Die Hungerphase verkürzen; die Zellviabilität vor dem Anritzen überprüfen; CO₂-Gehalt und Temperatur kontrollieren |
| Hohe Schwankungen von Bohrloch zu Bohrloch | Ungleichmäßige Kratzerlänge oder Bildgebung an verschiedenen Positionen | Markierungsplatte; Bild an identischen Positionen; Quantifizierung von 70–80% Kratzern pro Vertiefung |
| Zelltrümmer im Kratzer | Unvollständige PBS-Spülung | Sofort nach dem Kratzen 2–3 Mal mit warmem PBS waschen |
| Migration und Proliferation lassen sich nicht unterscheiden | Keine Kontrolle der Verbreitung | Fügen Sie einen mit Mitomycin C behandelten Kontrollarm hinzu; nutzen Sie die Live-Zell-Bildgebung zur kinetischen Trennung |
4. Serum-Strategie: Welche FBS-Qualitätsstufe soll verwendet werden?
Serum spielt im Scratch-Assay eine doppelte Rolle – es unterstützt das Überleben der Zellen und liefert Wachstumsfaktoren, die die Migration anregen. Die größte Herausforderung besteht darin, Entkopplung von Migration und Proliferation. Die Wahl des Serums ist daher eine der wichtigsten Entscheidungen im Versuchsablauf.
Phase 1 – Zellvermehrung (vor dem Assay)
Verwendung Standard FBS bei 10% bis die Zellen in der Routinezellkultur die Konfluenz erreichen. Dabei ist eine gleichbleibende Qualität von Charge zu Charge wichtig – Schwankungen im Wachstumsfaktorgehalt zwischen den einzelnen Chargen wirken sich direkt darauf aus, wie schnell die Zellen die Konfluenz erreichen, sowie auf ihren grundlegenden Migrationsphänotyp. Für Längsschnittstudien wird die Reservierung bestimmter Chargen dringend empfohlen.
Phase 2 – Hungermedium
Ersetzen durch serumfreies Medium oder 0,5% FBS 16–24 Stunden vor dem Kratzen. Dies synchronisiert den Zellzyklus, reduziert die basale ERK/PI3K-Signalübertragung und stellt sicher, dass die durch die Wunde ausgelöste Migration das vorherrschende beobachtete Verhalten ist. Bei Primärzellen oder empfindlichen Zelllinien, die einen vollständigen Serumentzug nicht vertragen, gewährleistet 0,5–1% FBS die Lebensfähigkeit, ohne die Proliferation nennenswert anzuregen.
Phase 3 – Testmedium (während des Lückenschlusses)
Führen Sie die Migrationsphase in 1–2% FBS mittel es sei denn, Ihr Assay untersucht gezielt die Wirkung von Serumkomponenten. Bei Anwendungen im Bereich des Wirkstoff-Screenings, bei denen Endotoxine die durch Zytokine gesteuerte Signalübertragung stören könnten, sollten Sie Folgendes berücksichtigen: Geringer Endotoxingehalt FBS (<1 EU/ml) um durch LPS ausgelöste Hintergrundentzündungsreaktionen zu unterbinden.
Zusammenfassung zur Materialauswahl für die Sorte FBS
| Anwendung | Empfohlene Klassenstufe | Konzentration |
|---|---|---|
| Zellvermehrung bis zur Konfluenz | FBS-Standard | 10% |
| Hunger (serumempfindliche Zelllinien) | FBS-Standard | 0.5–1% |
| Migrationsphase (Standard) | FBS-Standard | 1–2% |
| Wirkstoff-/Zytokin-Screening | FBS, endotoxinarme (<1 EU/ml) | 1–2% |
| Antikörperabhängige Assays | FBS Niedriger IgG-Spiegel (< 200 µg/ml) | 1–10% |
Alle SeamlessBio- und FBS-Chargen stammen aus Südamerika (Standard), werden in Deutschland verarbeitet und einer Qualitätskontrolle unterzogen und mit vollständigen CoA-Testergebnissen versandt, einschließlich Sterilität, Mykoplasmen, Endotoxinen (LAL) und viraler Sicherheitsprüfung (BVDV, BHV-1, PI-3). Zum FBS-Portfolio →
5. Quantifizierung und Live-Zell-Bildgebung
Eine genaue, reproduzierbare Quantifizierung gilt als die am häufigsten genannte Schwäche des Scratch-Assays. Manuelle Messungen an nur einem einzigen Sichtfeld führen zu erheblichen Variabilitäten sowohl innerhalb eines Beobachters als auch zwischen verschiedenen Beobachtern. Studien haben gezeigt, dass die Bildaufnahme an mindestens 3–5 Positionen pro Vertiefung und die Erfassung von >70% der Kratzerlänge die Variabilität erheblich reduzieren und die Sensitivität des Assays verbessern.
Analyseansätze
- ImageJ / FIJI: Das MRI Wound Healing Tool (kostenlos, Open Source) misst die Fläche von Kratzern anhand von Hellfeldbildern. Geeignet für Studien mit geringem Durchsatz; erfordert eine konsistente Bildaufnahme.
- Automatisierte Live-Zell-Bildgebung: Ermöglicht kontinuierliche Zeitrafferaufnahmen, ohne die Umgebung im Inkubator zu stören, erfasst die Kinetik des Wundverschlusses (nicht nur den Endpunkt) und ermöglicht eine softwaregestützte Kantenerkennung zur objektiven Quantifizierung. Positionsschwankungen werden vollständig ausgeschlossen.
- Kommerzielle Software: IncuCyte (Sartorius), Cellomics oder die integrierte Analyse in Lebendzell-Bildgebungssystemen ermöglichen eine automatisierte Quantifizierung der Wundfläche mit minimalem manuellem Aufwand.
zenCELL owl – Live-Zell-Imager für Scratch-Assays
Der zenCELL owl ist ein kompakter Live-Cell-Imager, der in Ihren handelsüblichen CO₂-Inkubator eingesetzt wird und automatisch Hellfeld-Zeitrafferaufnahmen erstellt. Bei Scratch-Assays entfällt dadurch die Notwendigkeit, die Platten zwischen den einzelnen Bildaufnahmen aus dem Inkubator zu entnehmen – wodurch Artefakte durch Temperaturschwankungen reduziert werden und kontinuierliche kinetische Daten erfasst werden können.
Im Gegensatz zu Plattenlesegeräten oder Mikroskopen mit großem Platzbedarf ist das „Owl“-Gerät für Standardplatten mit 6 oder 24 Wells ausgelegt, wie sie bei routinemäßigen Scratch-Assays verwendet werden. Die Bilder werden in festgelegten Intervallen aufgenommen und zur Analyse in ImageJ, die integrierte Software, oder auf die Plattform Ihrer Wahl exportiert.
6. Empfohlene Reagenzien von SeamlessBio
FBS-Standard
Routinemäßige Zellvermehrungs- und Migrationsassays. Herkunft: Südamerika, aufbereitet in Deutschland. Enthält vollständige CoA-Zellen.
FBS-Standard anzeigen →FBS, endotoxinarme
<1 EU/ml Endotoxin. Unverzichtbar für Untersuchungen zu Zytokinen und Wachstumsfaktoren, bei denen eine LPS-Interferenz ausgeschlossen werden muss.
„Low Endotoxin FBS“ anzeigen →BSA – Rinderserumalbumin
Wird bei Blockierungsschritten, zur Solubilisierung von Wirkstoffen (z. B. TGF-β-Rekonstitution bei 1 mg/ml BSA in HCl) und bei serumfreien Formulierungen verwendet.
BSA anzeigen →zenCELL Eule
Inkubatorbasiertes Live-Zell-Bildgebungssystem für automatisierte Zeitrafferaufnahmen im Scratch-Assay. Erhältlich über innoME.
Mehr erfahren →7. Häufig gestellte Fragen
Der Scratch-Assay misst kollektive seitliche Wanderung einer Zellmonoschicht über eine zweidimensionale Oberfläche. Der Transwell-Assay (Boyden-Kammer) misst chemotaktische Migration von einzelnen Zellen durch eine Membranporen hin zu einem Chemoattraktant-Gradienten. Der Scratch-Assay eignet sich besser zur Untersuchung des kollektiven Verhaltens, der Wundheilungsbiologie und der Dynamik von Epithelschichten. Transwell wird bevorzugt für Untersuchungen zur gerichteten Chemotaxis und zur Invasion einzelner Zellen verwendet.
Das hängt von Ihrem Ziel ab. Wenn Sie messen möchten, reine Migration (keine Proliferation): Verwenden Sie während der Lückenschlussphase 0–1% FBS. Serumfreies Medium eignet sich für robuste Zelllinien, kann jedoch bei empfindlichen oder Primärzellen Apoptose auslösen. Ein praktischer Kompromiss ist 1% FBS mit einer 16–24-stündigen Hungerphase vor dem Kratzen. Für Zytokin-stimulierte Migrationsassays sollte Low-Endotoxin-FBS verwendet werden, um eine TLR4-Hintergrundaktivierung zu vermeiden.
Es gibt drei gängige Ansätze: (1) Serummangel bevor durch Kratzen die Proliferationssignale unterdrückt werden. (2) Mitomycin C (10 µg/ml, 2 Stunden vor dem Einritzen), um die Zellteilung zu hemmen, ohne die Migration direkt zu beeinflussen. (3) Kinetik der Live-Zell-Bildgebung — Durch die kontinuierliche Zeitrafferaufnahme lässt sich die Geschwindigkeit an der Vorderkante getrennt von der durch die Teilung bedingten Vergrößerung des Hauptbereichs beobachten.
Streben Sie zum Zeitpunkt des Kratzens eine Konfluenz von 90–100% an. Bei subkonfluenten Monolayern entstehen Lücken, die zu artefaktischen "Pseudo-Wunden" führen und variable Kratzbreiten zur Folge haben. Bei den meisten Krebszelllinien in 6-Well-Platten lässt sich dies durch eine Aussaat von 2–4 × 10⁵ Zellen/Well am Abend vor dem Assay erreichen. Optimieren Sie das Verfahren für Ihre spezifische Zelllinie – schnell wachsende Linien erfordern möglicherweise eine geringere Aussaatdichte.
Nehmen Sie zu jedem Zeitpunkt mindestens 3–5 Positionen pro Vertiefung auf (die ≥70% der Kratzerlänge abdecken). Verwenden Sie ImageJ mit dem „MRI Wound Healing Tool“ oder führen Sie eine automatisierte Analyse mittels eines Live-Cell-Imagers durch. Berechnung: %-Wundverschluss = [(A₀ − Aₜ) / A₀] × 100. Führen Sie stets eine Normalisierung auf das T=0-Bild derselben Vertiefungsposition durch, um Schwankungen in der Kratzerbreite zu berücksichtigen.
Für die Standard-Zellkultur und Routineuntersuchungen: FBS-Standard bei 10% für die Expansion und bei 1–2% während der Migration. Für das Screening von Wirkstoffen oder Zytokinen: FBS Geringer Endotoxingehalt (<1 EU/ml) um zu verhindern, dass LPS die Behandlungseffekte überdeckt. Für Assays mit antikörperbasierten Messwerten: FBS Niedriger IgG-Spiegel. Für alle Längsschnittstudien wird eine Chargenreservierung empfohlen – das Migrationsverhalten reagiert empfindlich auf Chargenschwankungen beim Gehalt an Wachstumsfaktoren.
Ja – kommerzielle Werkzeuge zur Wundbildung (z. B. WoundMaker, Essen BioScience) erzeugen standardisierte, reproduzierbare Kratzer in 96-Well-Platten und ermöglichen so ein Screening von Wirkstoffen mit hohem Durchsatz. Dieses Format lässt sich am besten mit einem automatisierten Live-Cell-Imager kombinieren, um eine kontinuierliche Überwachung ohne Beeinträchtigung der Wells zu gewährleisten.
zenCELL Owl Demo + FBS-Beispielpaket
Fordern Sie eine zenCELL owl-Demo für Ihren Scratch-Assay-Workflow an. Exklusives Paket: zenCELL owl-Demo + FBS-Probenset zur Protokollvorbereitung. Kostenlose FBS-Testmengen sind enthalten.
E-Mail: info@seamlessbio.de | +49 851 37932226 | zencellowl.com
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