Hybridomakultur und Herstellung monoklonaler Antikörper – Leitfaden zur Serumauswahl

Die Hybridom-Technologie bildet nach wie vor die Grundlage für die Entwicklung monoklonaler Antikörper. Vier der zehn meistverkauften Antikörpermedikamente stammen aus Hybridom-basierten Programmen. Jedes Hybridom-Labor benötigt Serum – und die verwendete Qualität bestimmt direkt die Fusionseffizienz, die Empfindlichkeit beim Klon-Nachweis und die Reinheit der Antikörper. Dieser Leitfaden behandelt den gesamten Arbeitsablauf von der Immunisierung bis zur Formulierung.

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Warum FBS Ultra Low IgG die richtige Qualität für die Hybridomakultur ist: Standard FBS enthält 200–800 µg/ml Rinder-IgG. Beim Screening von Hybridom-Überständen verursacht Rinder-IgG ein starkes Hintergrundsignal im ELISA – wodurch Klone mit niedrigem Titer überdeckt werden. Bei der nachgelagerten Aufreinigung wird Rinder-IgG zusammen mit dem Ziel-mAb auf Protein-A/G-Säulen mitaufgereinigt, was die Reinheit verringert. FBS Ultra Low IgG <5 µg/ml beseitigt beide Probleme bereits an der Quelle.

Hybridom-Arbeitsablauf – Serum in jeder Phase

Bühne	Prozessschritt	Produktempfehlung	Grundgedanke
Impfung	Immunisierung von Wirtstieren (Maus, Ratte, Kaninchen, Ziege)	Artenentsprechendes Präimmunserum als negative ELISA-Kontrolle: Maus \| Ratte \| Kaninchen \| Ziegenserum	Vor der Immunisierung entnommenes Serum, das als Negativkontrolle für die Titerüberwachung während des gesamten Impfprogramms benötigt wird
Fusion	Fusion von B-Zellen und Myelomzellen – PEG oder Elektrofusion	FBS Extrem niedriger IgG-Wert <5 µg/ml — 10–20% in HAT-Medium	Ein niedriger IgG-Spiegel verringert den ELISA-Hintergrund beim Screening nach der Fusion. Für das HAT-Medium ist hochwertiges Serum erforderlich, um eine effiziente Aufnahme von Hypoxanthin und Thymidin zu gewährleisten.
HAT-Auswahl	Selektive Kultivierung von Hybridomaklonen in HAT-Medium	FBS Extrem niedriger IgG-Wert <5 µg/ml — 10–20%	Gleichbleibende Chargenqualität ist entscheidend – die Effizienz der HAT-Auswahl variiert je nach FBS-Charge. Eine Chargenreservierung wird dringend empfohlen.
Vorführung	ELISA-Screening von Hybridom-Überständen	FBS Extrem niedriger IgG-Wert <5 µg/ml + BSA, endotoxinarme zur ELISA-Blockierung	Rinder-IgG erzeugt einen ELISA-Hintergrund, der positiv getestete Klone mit niedrigem Titer überdeckt. BSA Low Endotoxin bei 1–3% in PBS-Tween als Blockierungsmittel.
Klonieren	Begrenzte Verdünnung oder FACS-Einzelzell-Sortierung	FBS Extrem niedriger IgG-Wert <5 µg/ml — 20% zur Einzelzellgewinnung	Ein höherer Serumgehalt fördert die Einzelzellgewinnung. Feederzellen (Peritonealmakrophagen) – es wird artengerechtes Serum empfohlen.
Erweiterung	Aufskalierung positiver Klone	FBS Extrem niedriger IgG-Wert <5 µg/ml — 5–10%	Das Serum bei der Expansion reduzieren, um die Konzentration an Rinder-IgG im Überstand vor der Aufreinigung zu senken.
Produktion	Antikörperproduktion – statische Kolben, Rollflaschen, Bioreaktor	FBS Extrem niedriger IgG-Wert <5 µg/ml — 2–5% oder serumfrei	Serumgehalt bei der Herstellung minimieren – geringere Mitreinigung von Rinder-IgG auf Protein A/G. Für monoklonale Antikörper der GMP-Qualität wird serumfrei bevorzugt.
Reinigung	Protein A/G, Pufferaustausch, Formulierung	BSA Geringer Endotoxingehalt ≤ 5 EU/mg im Formulierungspuffer	BSA im Bereich von 0,001–0,1% verhindert die Adsorption von monoklonalen Antikörpern an den Oberflächen der Fläschchen. Eine hohe Endotoxin-Reinheit ist unerlässlich.

Standard FBS im Vergleich zu FBS Ultra Low IgG – Was ist der Unterschied?

Parameter	Standard FBS	FBS Extrem niedriger IgG-Wert <5 µg/ml
Gehalt an Rinder-IgG	200–800 µg/ml	<5 µg/ml — chromatographisch entfernt
Hintergrund zum ELISA-Screening	Hoch – Rinder-IgG zeigt Kreuzreaktionen mit Sekundärantikörpern gegen Maus/Kaninchen	Minimal – Hintergrund entfernt
Protein-A/G-Aufreinigung	Rinder-IgG wird mitgereinigt – dies mindert die Reinheit des monoklonalen Antikörpers	Keine Mitreinigung von Rinder-IgG
Empfindlichkeit der Klonerkennung	Klone mit niedrigem Titer, die durch den Hintergrund überdeckt werden	Volle Erkennungsempfindlichkeit – keine Maskierung
Wachstumsfaktoren / Albumin	Standardstufen	Vollständig erhalten – der Abbau erfolgt ausschließlich IgG-spezifisch

Tiersera für die Immunisierung – Kontrollen vor der Immunisierung

In jeder Phase des Immunisierungsprogramms wird artspezifisches Serum als Negativkontrolle benötigt – für die Ausgangswerte vor der Immunisierung, für Titerkontrollen während des Programms sowie für den Vergleich der Blutentnahmen am Programmende. SeamlessBio liefert Seren aller gängigen Labortierarten.

Art	Bewerbung im mAb-Programm	Produkt
Maus (BALB/c)	Häufigster Hybridom-Wirt – Präimmunserum für den ELISA-Ausgangswert. Durchgehend normales Mäuseserum als Negativkontrolle.	Mausserum →
Ratte	Hybridom-Programme bei Ratten. Herstellung von Ratten-Antikörpern gegen Mäuse.	Ratten-Serum →
Kaninchen	Programme zur Entwicklung von Antikörpern mit hoher Affinität. Immortalisierung von B-Zellen. Präimmune Kontrolle.	Kaninchenserum →
Ziege	Herstellung polyklonaler Antikörper. Präimmunes Ziegenserum als ELISA-Blockierungsmittel für aus Ziegen gewonnene Sekundärantikörper.	Ziegenserum →
Schaf	Polyklonale Programme bei Schafen. Normales Schafserum als Blockierungsmittel.	Schafserum →
Meerschweinchen	Komplementquelle für CDC- und Komplementfixierungs-Assays. Sehr starke Komplementaktivität.	Meerschweinchen-Serum →

BSA in der Antikörperherstellung – Wichtigste Anwendungsbereiche

Anwendung	Güteklasse BSA	Konzentration	Funktion
ELISA-Blocking-Puffer	BSA Geringer Endotoxingehalt ≤ 5 EU/mg	1–3% in PBS-T	Verhindert unspezifische Bindung – ein niedriger Endotoxingehalt ist entscheidend, um eine Zellaktivierung während des Blockiervorgangs zu vermeiden
Puffer zur Verdünnung von Antikörpern	BSA, endotoxinarme	0.1–1%	Stabilisiert den Antikörper während der seriellen Verdünnung – verhindert die Adsorption an den Röhrchenwänden
Konjugationspuffer (HRP, Biotin, Fluorophor)	BSA Fettsäurefrei	0.1%	Proteinstabilisator bei Konjugationsreaktionen – frei von Fettsäuren, verhindert Lipidinterferenzen
Formulierungspuffer	BSA, endotoxinarme	0.001–0.1%	Verhindert die Adsorption von monoklonalen Antikörpern an den Oberflächen der Fläschchen während der Lagerung von Antikörpern in geringer Konzentration

Human-Serum-Antikörper gegen humanes Hybridom und EBV-Immortalisierung

Für Programme zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper (mAb), bei denen EBV-Immortalisierung humaner B-Zellen oder die Technologie humaner Hybridome zum Einsatz kommt, wird Humanserum benötigt – nicht FBS. Humane B-Zellen benötigen eine artspezifische Matrix.

Anwendung	Produkt	Warum
EBV-immortalisierte Kultur menschlicher B-Zellen	Humanes Serum AB, hitzeinaktiviert — 10%	HI verhindert die komplementvermittelte Lyse von EBV-immortalisierten B-Zellen. Der AB-Typ verhindert die Blutgruppenagglutination.
Hybridomkultur aus menschlichen Zellen	Humanes Serum AB HI — 10–20%	Artenangepasste Matrix für Hybridomprodukte vom Typ „Mensch × Mensch“. Verhindert eine xenogene Stimulation durch Rinderkomponenten.

Häufig gestellte Fragen

Warum wird FBS Ultra Low IgG für die Hybridomakultur benötigt?

Der Standard FBS enthält 200–800 µg/ml Rinder-IgG. Wenn Hybridom-Überstände mittels ELISA mit Anti-Maus- oder Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern untersucht werden, kommt es zu einer Kreuzreaktion des Sekundärantikörpers mit dem Rinder-IgG – wodurch ein Hintergrundsignal entsteht, das positive Klone mit niedrigem Titer überdeckt. Zudem wird Rinder-IgG zusammen mit dem Ziel-mAb auf Protein-A/G-Säulen gereinigt, was die endgültige Reinheit verringert. FBS Ultra Low IgG <5 µg/ml beseitigt beide Probleme bereits an der Quelle.

Welche BSA-Qualität wird für die ELISA-Blockierung beim Hybridom-Screening verwendet?

BSA „Low Endotoxin“ ≤5 EU/mg ist die richtige Qualität. BSA mit hohem Endotoxingehalt aktiviert Zellen während der Blockierungsinkubation und erzeugt ein unspezifisches ELISA-Signal. Für maximale Assay-Empfindlichkeit bei ELISAs zum Hybridom-Screening ist die Verwendung von BSA mit niedrigem Endotoxingehalt in einer Konzentration von 1–3% in PBS-Tween-Blockierungspuffer der Standardansatz.

Kann ich für die Immunisierungsphase Standard-FBS verwenden?

Die Immunisierungsphase erfolgt nicht in Zellkultur – es handelt sich um einen In-vivo-Prozess. FBS wird nicht zur Immunisierung verwendet. Erforderlich ist artgerechtes Präimmunserum des Wirtstiers als negative ELISA-Kontrolle zur Titerüberwachung während des gesamten Immunisierungsprogramms.

Welches Serum aus Meerschweinchen eignet sich als Komplement in CDC-Assays?

Normales Meerschweinchen-Serum ist die Standardquelle für Komplement bei CDC- und Komplementfixierungs-Assays. Meerschweinchen-Komplement ist hochaktiv und breit reaktiv – die gängige Wahl für CDC-Assays bei der Charakterisierung von aus Hybridomen gewonnenen Anti-Tumor-monoklonalen Antikörpern.

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FBS mit extrem niedrigem IgG-Gehalt, Tierseren und BSA mit niedrigem Endotoxingehalt sind verfügbar. Chargenspezifische IgG-Daten. Chargenreservierung für umfangreiche Hybridomprogramme.
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