Radioaktive Markierung, LC-MS/MS oder Fluoreszenz – Auswahl einer Nachweismethode für Vesikeltransport-Assays
Der Transporter-Assay ist in allen drei Fällen derselbe. Der Unterschied liegt darin, wie man misst, was letztendlich in die Vesikel gelangt ist – und diese Wahl bestimmt den Durchsatz, die Infrastruktur und darüber, ob eine Aufsichtsbehörde die Ergebnisse akzeptiert.
Was alle drei gemeinsam haben
Die biologischen Vorgänge sind identisch. Nur die Auswertung ändert sich.
In jedem Fall inkubiert man invertierte Membranvesikel mit einem Probesubstrat, einmal in Gegenwart von ATP und einmal mit AMP. Die ATP-abhängige Fraktion – also die Differenz zwischen den beiden – entspricht dem tatsächlichen Transport. Die Vesikel werden anschließend auf einem Filter aufgefangen, gewaschen und die darin angesammelte Menge quantifiziert.
Das Nachweiskonzept ist dieser letzte Schritt. Es verändert zwar nicht die Transportbiologie, aber es bestimmt, was gemessen werden kann, wie viele Verbindungen pro Tag und welche Geräte für die Arbeit erforderlich sind.
Die drei Methoden
Radioaktive Markierung
Ein mit ³H oder ¹⁴C markiertes Probesubstrat. Die akkumulierte Radioaktivität wird mittels Szintillationszählung gemessen.
Sehr empfindlich, sehr geringer Hintergrund und das Format, auf dem die meisten veröffentlichten Referenzdaten basieren.
LC-MS/MS
Unmarkiertes Substrat, das nach der Lyse der Vesikel mittels Chromatographie und Massenspektrometrie quantifiziert wurde.
Die einzige Methode, mit der sich die Testverbindung selbst und nicht ihre Wirkung auf eine Sonde messen lässt.
Fluoreszenz
Ein Substrat für eine Fluoreszenzsonde, das mit einem handelsüblichen Plattenlesegerät ausgelesen wird.
Am schnellsten und günstigsten, ohne spezielle Genehmigung – allerdings hängt es davon ab, welche Transportunternehmen über eine einsatzfähige Sonde verfügen.
Seite an Seite
| Radioaktive Markierung | LC-MS/MS | Fluoreszenz | |
|---|---|---|---|
| Empfindlichkeit | Sehr hoch | Hoch | Mäßig |
| Durchsatz | Mäßig | Niedriger — Laufzeit pro Sample | Hoch |
| Misst die Testverbindung selbst | Nur wenn gekennzeichnet | Ja | Nein |
| Methodenentwicklung pro Verbindung | Keine | Erforderlich | Keine |
| Infrastruktur | Genehmigung für radiochemische Arbeiten, ausgewiesener Bereich, Szintillationszähler | LC-MS/MS-Gerät | Kennzeichenlesegerät |
| Abfallentsorgung | Radioaktiver Abfall | Standardlösungsmittel | Standard |
| Störungsrisiko | Niedrig | Matrixeffekte, Ionenunterdrückung | Autofluoreszenz, Löschung |
| Regulierungsbefugnis | Referenzverfahren | Angenommen | Belegende Beweise |
Radioaktives Marker — die Referenz, mit einer Anforderung an die Einrichtung
Wenn Sie bereits mit Radioaktivität zu tun haben, ist dies in der Regel die einfache Antwort.
Radioaktiv markierte Sonden-Substrate sind für Efflux-Transporter seit Langem etabliert, und die in der Literatur angegebenen Referenzwerte wurden größtenteils auf diese Weise ermittelt. Das ist wichtiger, als es zunächst klingt: Wenn ein Gutachter Ihren IC vergleicht50 Im Vergleich zu veröffentlichten Daten für denselben Transporter lässt die Vergleichbarkeit der Methode einen Zweifelspunkt ausräumen.
Typische Sonden-Substrate im vesikulären Format:
| Transporter | Gängiges Sonden-Substrat |
|---|---|
| BSEP | Taurocholat |
| BCRP | Estron-3-sulfat |
| MRP1, MRP2, MRP3 | Estradiol-17β-Glucuronid |
| MRP4 | DHEAS oder zyklische Nukleotide |
| P-gp | N-Methylchinidin |
Die für das Kit spezifischen Substrate und die empfohlenen Konzentrationen sind dem Datenblatt zu entnehmen – betrachten Sie die obige Tabelle bitte als Orientierungshilfe und nicht als Assay-Protokoll.
LC-MS/MS – wenn Sie die Verbindung selbst benötigen
Das einzige Format, bei dem der Analyt Ihr Molekül selbst und nicht ein Ersatzstoff sein kann.
Diese eine Eigenschaft beantwortet Fragen, die die beiden anderen nicht beantworten können:
- Ist meine Verbindung ein Substrat? Bestimmen Sie, wie viel davon sich ATP-abhängig in der Vesikel angesammelt hat.
- Arbeit zu Metaboliten. Metaboliten sind selten markiert und fast nie fluoreszierend – lassen sich jedoch routinemäßig mittels Massenspektrometrie nachweisen.
- Keine radiochemische Einrichtung. Für viele Labore ist dies der ausschlaggebende Faktor, und das ist durchaus berechtigt.
Der Preis dafür ist die Methodenentwicklung. Für jede neue Verbindung sind eine Übergangsphase, eine Kalibrierung und eine Überprüfung auf Matrixeffekte erforderlich, bevor der Assay durchgeführt werden kann. Bei einer einzelnen Verbindung dauert das einen Tag; bei einer Screening-Kaskade wird dies zum Engpass.
Fluoreszenz – schnell, kostengünstig, schmaler
Zur Triage geeignet, als alleiniger Beweis in einem Antrag jedoch ungeeignet.
Ein Plattenlesegerät, keine Lizenz, keine Methodenentwicklung und Ergebnisse innerhalb weniger Minuten. Für die Einstufung einer Verbindungsreihe oder die Vorauswahl einer Bibliothek, bevor man sich auf eine endgültige Methode festlegt, ist diese Kombination kaum zu übertreffen.
Drei Einschränkungen:
- Nicht jeder Transporter verfügt über eine brauchbare Fluoreszenzsonde. Bei manchen ist die Abdeckung gut, bei anderen fehlt sie gänzlich.
- Die Sonde ist ein anderes Molekül. Ein Transporter kann ein mit einem Fluorophor markiertes Substrat anders behandeln als ein physiologisches, sodass sich absolute Werte nicht immer zwischen den verschiedenen Nachweismethoden übertragen lassen.
- Kombinierte Störung. Autofluoreszenz und Löschung treten bei arzneimittelähnlichen Molekülen häufig auf, und beide führen zu Ergebnissen, die wie Transporteffekte aussehen, es aber nicht sind.
Wie man sich entscheidet
| Ihre Situation | Verfahren |
|---|---|
| IC50 für eine DDI-Einreichung | Radioaktive Markierung oder LC-MS/MS |
| Keine radiochemische Einrichtung | LC-MS/MS |
| Ist meine Verbindung ein Substrat? | LC-MS/MS oder ein zellbasierter Assay |
| Metaboliten | LC-MS/MS |
| Untersuchung einer großen Fallreihe | Fluoreszenz: Bestätigen Sie die Treffer mit einer anderen Methode |
| Vergleich mit veröffentlichten Referenzwerten | Radioaktive Markierung |
| Die Verbindung ist gefärbt oder autofluoreszierend | Keine Fluoreszenz |
Die meisten gut konzipierten Kaskaden nutzen zwei Verfahren: ein schnelles Verfahren zur Vorauswahl und ein fundiertes Verfahren für die Verbindungen, die diese Vorauswahl überstehen.
Was unabhängig von der Methode gleich bleibt
- In jedem Durchlauf Kontrollvesikel einbeziehen. Der ATP-abhängige Transport ist der Unterschied zwischen den Transportervesikeln und den nicht transfizierten Kontrollen – siehe die Kit für Human-Kontrollvesikel.
- AMP als negativer Zustand, nicht der Wegfall von ATP – dadurch bleibt das ionische Milieu vergleichbar.
- Chargenspezifische Transportverhältnisse. Ein niedriges ATP/AMP-Verhältnis schränkt das Messfenster ein und erhöht die Variabilität, unabhängig davon, womit Sie messen.
- Das Expressionssystem. Die Glykosylierung und die Zusammensetzung der Membranlipide unterscheiden sich je nach Wirtszelle – behandelt in HEK293 im Vergleich zu Sf9-Vesikeln.
Häufig gestellte Fragen
Welche Erkennungsmethode erwarten die Aufsichtsbehörden?
ICH M12 schreibt keine vor. In der Praxis gilt für IC50 Die für die Bewertung des Efflux-Transporters DDI vorgelegten Werte stammen überwiegend aus radioaktiv markierten Proben oder aus LC-MS/MS-Analysen. Fluoreszenzdaten dienen in der Regel eher als ergänzende Belege denn als primäre Bestimmungsgrundlage.
Kann ich vesikuläre Assays ohne eine radiochemische Genehmigung durchführen?
Ja. Sowohl LC-MS/MS als auch die Fluoreszenzmethode kommen gänzlich ohne Radioaktivität aus. LC-MS/MS ist die Methode, die für behördliche Zwecke weiterhin vertretbar ist.
Warum kann ich anhand der radioaktiven Markierung nicht feststellen, ob meine Verbindung ein Substrat ist?
Denn die Markierung befindet sich an der Sonde und nicht an Ihrer Verbindung. Sie messen, wie Ihre Verbindung den Transport einer anderen Substanz beeinflusst. Um festzustellen, ob Ihr Molekül selbst transportiert wird, muss es der Analyt sein – was LC-MS/MS oder eine maßgeschneiderte Markierung erfordert.
Meine Verbindung ist fluoreszierend. Kann ich trotzdem einen Fluoreszenztest durchführen?
Nur mit Vorsicht und erst, nachdem eine Kontrolle ausschließlich mit der Substanz bestätigt hat, dass diese die Messwerte nicht beeinflusst. In den meisten solchen Fällen ist ein Wechsel der Methode schneller als eine Validierung unter Umgehung des Problems.
Liefern die drei Methoden denselben IC50-Wert?
In der Regel liegen die Werte in derselben Größenordnung, sind jedoch nicht immer identisch. Verschiedene Sonden-Substrate interagieren unterschiedlich mit dem Transporter. Wenn die Werte von Bedeutung sind, sollten Sie die Methode innerhalb eines Projekts einheitlich anwenden und dies im Bericht angeben.
Sind die Vesikel-Kits von Cell4Pharma mit allen drei kompatibel?
Ja – die Vesikel sind unabhängig von der Auswertungsmethode identisch. Welches Proben-Substrat und welche Konzentration verwendet werden sollen, hängt vom jeweiligen Transporter ab; im Datenblatt sind die validierten Bedingungen für jedes Kit angegeben.
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