„Off-the-Clot“ vs. aus Plasma gewonnenes Humanserum – Warum die Entnahmemethode Ihre Kultur beeinflusst
Beide Produkte werden als "Humanserum" verkauft. Sie werden auf grundlegend unterschiedliche Weise hergestellt, und bei empfindlichen Primärzellen ist dieser Unterschied messbar.
Wie Off-the-Clot-Serum hergestellt wird
Zu keinem Zeitpunkt kommt ein Antikoagulans mit dem Blut in Berührung.
- Vollblutspende in ein einfaches Röhrchen oder einen Beutel – ohne Citrat, ohne EDTA, ohne Heparin.
- Natürliche Blutgerinnung. Die Gerinnungskaskade durchläuft ihren physiologischen Verlauf. Es wird Thrombin gebildet, Fibrinogen wandelt sich in Fibrin um, und es bildet sich ein Gerinnsel.
- Thrombozytenaktivierung. Während sich das Gerinnsel bildet, entladen die Blutplättchen ihre α-Granula und geben deren Inhalt in die umgebende Flüssigkeit ab – darunter PDGF, TGF-β, VEGF, EGF und IGF-1.
- Rückbildung des Gerinnsels unter Kühlung, anschließend Zentrifugation.
- Das Serum wird abgezogen das Gerinnsel. Was in der Lösung verbleibt, ist das Serum, das nun kein Fibrinogen und keine verbrauchten Gerinnungsfaktoren mehr enthält und mit allem angereichert ist, was die Blutplättchen freigesetzt haben.
Dieser letzte Punkt ist derjenige, auf den es wirtschaftlich gesehen ankommt. Die Wachstumsfaktoren im Serum aus dem Blutgerinnsel sind darin enthalten, weil sie durch den Gerinnungsprozess dorthin gelangt sind. Sie sind kein Zusatzstoff.
Wie aus Plasma gewonnenes Serum hergestellt wird
Zunächst wird die Gerinnung verhindert, später dann ausgelöst – also in umgekehrter Reihenfolge.
- Probenentnahme mit Antikoagulans, in der Regel Natriumcitrat. Citrat bindet Kalzium, das in mehreren Schritten der Gerinnungskaskade benötigt wird.
- Plasmatrennung aus der Zellfraktion. Je nach Verfahren werden in dieser Phase die meisten Thrombozyten entfernt.
- Rekalkifizierung. Calciumchlorid wird zugesetzt, um den Citratblock zu überwinden und die Gerinnung zu erzwingen.
- Das Fibringerinnsel wird entfernt, und der Rest wird als Serum verkauft.
Chemisch gesehen ähnelt das Produkt Serum. In drei Punkten gibt es jedoch grundlegende Unterschiede.
Weniger von Thrombozyten stammende Wachstumsfaktoren
Wurden bei der Plasmaaufbereitung Thrombozyten entfernt, waren diese nicht mehr vorhanden, um bei der anschließenden Gerinnungsinduktion zu degranulieren. Die Wachstumsfaktoren, die sie freigesetzt hätten, fehlen somit gänzlich.
Dies ist der größte funktionale Unterschied, und genau deshalb können die beiden Produkte in derselben Kultur unterschiedlich wirken.
Citratrückstände und veränderte Ionen
Citrat wird nicht entfernt – es verbleibt im Produkt in Form von Calciumcitrat-Komplexen. Natriumcitrat führt zudem zu einer erhöhten Natriumzufuhr, und die Rekalkifizierung führt zu einer erhöhten Chloridzufuhr.
Der Gehalt an freiem Kalzium in Ihrem Medium ist daher geringer, als der Nennwert vermuten lässt.
Und ein dritter, weniger diskutierter Faktor: Restfibrinogen
Ist die Rekalkifizierung unvollständig, bleibt ein Teil des Fibrinogens während des Prozesses erhalten. In der Praxis äußert sich dies durch die Bildung von Gel oder Fasern nach dem Einfrieren und Auftauen oder durch fadenförmiges Material im Kulturgefäß. Dies kommt zwar nicht häufig vor, doch wenn sich eine Serumcharge auf diese Weise verhält, ist eine unvollständige Rekalkifizierung eine wahrscheinliche Erklärung.
Seite an Seite
| Off-the-Clot | Aus Plasma gewonnen (rekalkifiziert) | |
|---|---|---|
| Ausgangsmaterial | Vollblut, ohne Zusatzstoffe | Antikoaguliertes Plasma |
| Blutgerinnung | Natürlicher, physiologischer Ablauf | Später durch Zugabe von Kalzium ausgelöst |
| Wachstumsfaktoren der Blutplättchen | Wird während der Blutgerinnung ins Serum freigesetzt | Je nach Verfahren reduziert oder nicht vorhanden |
| Antikoagulansrückstände | Keine | Citrat vorhanden |
| Freies Kalzium | Physiologisch | Teilweise an Citrat gebunden |
| Restrisiko durch Fibrinogen | Sehr niedrig | Möglich, wenn die Rekalkifizierung unvollständig ist |
| Erhebungsmethode | Vollblutspende | Häufig Plasmapherese |
| Verfügbarkeit | Begrenzt | Gut |
| Preis | Höher | Nach unten |
Warum „Off-the-Clot“ seltener und teurer ist
Es handelt sich um eine Lieferengpasssituation, nicht um eine Margenentscheidung.
Für die Gewinnung von gerinnungsfreiem Serum ist eine Vollblutspende erforderlich. Bei der Plasmapherese – bei der Plasma entnommen und die Zellen dem Spender wieder zugeführt werden – wird pro Spende ein weitaus größeres verwertbares Volumen gewonnen, und das Verfahren kann wesentlich häufiger wiederholt werden. Es ist die vorherrschende Entnahmemethode, insbesondere in den Vereinigten Staaten, und liefert Plasma statt Serum.
Die Knappheit verschärft sich noch, wenn man zusätzlich eine bestimmte Blutgruppe benötigt: Spender der Blutgruppe AB machen etwa vier Prozent der europäischen Bevölkerung aus, und die Blutgruppe AB, die nicht gerinnt, ist die Schnittmenge zweier begrenzter Genpools.
Wenn der Unterschied tatsächlich eine Rolle spielt
„Off-the-Clot“ für angeben
- MSC-Erweiterung und ATMP-Prozesse — Die Proliferation hängt direkt vom Wachstumsfaktorprofil ab
- Primäre menschliche Zellen, insbesondere die langsam wachsenden
- Arbeiten zu kalziumabhängigen Assays und Signalwegen — Restcitrat senkt den Gehalt an freiem Kalzium
- Untersuchungen zur Integrin-vermittelten Adhäsion — Die Integrinbindung ist kalzium- und magnesiumabhängig
- Jedes Verfahren, bei dem FBS durch Humanserum ersetzt wird, wo die Leistung angepasst werden muss
Aus Plasma gewonnenes ist in Ordnung für
- Etablierte, verewigte Zelllinien — robust, anspruchlos
- Immunoassay-Matrix und diagnostischer Hintergrund — Man braucht eine menschliche Matrix, keine Wachstumsfaktoren
- Verblockung und Stabilisierung in Assay-Puffern
- Proteinstandards sowie Referenzmaterial
Die Zahlung einer überhöhten Prämie für diese Anwendungen bedeutet eine Ausgabe ohne Gegenleistung.
So finden Sie heraus, welche Programme Sie derzeit nutzen
In vielen Datenblättern wird dies nicht angegeben. Fragen Sie direkt nach.
Achten Sie im Analysezertifikat oder im Datenblatt auf folgende Begriffe:
| Formulierung | Bedeutet |
|---|---|
| Ohne Gerinnsel · aus Vollblut · natürliche Gerinnung · ohne Antikoagulans | Off-the-Clot |
| rekalkifiziert · aus Plasma gewonnen · aus Plasma · defibriniertes Plasma | Nicht von der Stange |
| Quelle: Plasmapherese · Apherese-Plasma | Mit ziemlicher Sicherheit erneut verkalkt |
| Überhaupt keine Stellungnahme | Fragen Sie nach. Lieferanten, die Zahlungen vor Ort entgegennehmen, weisen darauf hin, da dies ein Verkaufsargument ist. |
Wenn Sie einen neuen Lieferanten prüfen, nehmen Sie die Frage in die Ausschreibungsunterlagen auf und nicht in die Anfrage-E-Mail. Ein Lieferant, der diese Frage nicht schriftlich beantworten kann, sendet Ihnen damit ein Signal.
Ein häufig auftretendes Missverständnis, das es zu klären gilt
Aus Plasma gewonnenes Serum ist kein Plasma. Plasma enthält nach wie vor Fibrinogen und den vollständigen Komplex an Gerinnungsfaktoren. Aus Plasma gewonnenes Serum wurde geronnen und das Fibrin entfernt – es handelt sich also um Serum, das lediglich auf einem anderen Weg hergestellt wurde.
Falls Ihre Anwendung tatsächlich Plasma benötigt, handelt es sich dabei um ein eigenständiges Produkt mit eigenen Spezifikationen: Humanplasma und Aphereseplasma.
Häufig gestellte Fragen
Was bedeutet „off-the-clot“?
Das Serum wurde aus Vollblut gewonnen, das auf natürliche Weise geronnen war, ohne dass zu irgendeinem Zeitpunkt ein Antikoagulans zugesetzt wurde und ohne künstliche Rekalkifizierung. Die Gerinnungskaskade verläuft physiologisch.
Ist Serum aus dem Blutgerinnsel immer besser?
Nein. Es ist vor allem dort von Vorteil, wo das Wachstumsfaktorprofil oder das freie Kalzium eine Rolle spielen – bei der Vermehrung von MSCs, bei Primärzellen und bei kalziumabhängigen Assays. Bei etablierten Zelllinien und Anwendungen mit diagnostischen Matrizen bietet es keinen messbaren Vorteil gegenüber rekalkifiziertem Serum.
Hat Citratrückstand tatsächlich Auswirkungen auf die Zellkultur?
Es senkt die Konzentration an freiem Kalzium im Medium, da Citrat Kalzium bindet. Ob dies Ihre Zellen erreicht, hängt von der Menge ab und davon, wie kalziumempfindlich Ihr System ist. Für die Integrin-vermittelte Adhäsion und die Kalzium-Signalübertragung ist dies ein wichtiger Faktor; bei der routinemäßigen Zellkultur spielt dies in der Regel keine Rolle.
Warum bildet mein Serum nach dem Auftauen Fäden oder ein Gel?
Eine mögliche Erklärung ist verbleibendes Fibrinogen, und eine unvollständige Rekalkifizierung ist eine häufige Ursache. Im Serum, das direkt vom Gerinnsel stammt, ist im Wesentlichen kein Fibrinogen mehr vorhanden, da der Gerinnungsprozess bereits abgeschlossen war, bevor das Serum abgetrennt wurde.
Kann ich „Off-the-Clot“ mit Blutgruppe AB und männlichen Spendern kombinieren?
Ja, diese Merkmale sind unabhängig voneinander. Die Verfügbarkeit sinkt mit jeder zusätzlichen Einschränkung; überprüfen Sie daher den aktuellen Lagerbestand, bevor Sie die Kombination in eine Spezifikation aufnehmen.
Wie kann ich überprüfen, was mein derzeitiger Anbieter liefert?
Achten Sie im Datenblatt auf die Angaben "off-the-clot", "aus Vollblut" oder "ohne Antikoagulans". Wenn die Bezeichnung "rekalkifiziert", "aus Plasma gewonnen" oder "aus Plasma" lautet, handelt es sich nicht um „off-the-clot“. Falls keine Angabe vorhanden ist, fragen Sie schriftlich nach.
Spielt der „Off-the-Clot“-Effekt bei Immunoassay-Anwendungen eine Rolle?
In der Regel nicht. In diesem Fall benötigt man eher eine repräsentative menschliche Matrix als ein Wachstumsfaktorprofil, und gepooltes Standardserum ist in der Regel die richtige Wahl. Siehe Humanserum für Immunoassays.
Kann ich ein Muster erhalten, bevor ich mich festlege?
Ja. Bei Serum ist die Prüfung der eigenen Zellen anhand der jeweiligen Charge die einzige zuverlässige Qualifizierung – Spezifikationen erfassen nicht alle relevanten Aspekte.
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