August 2026 · 6 Min. Lesezeit
Die Wahl des Blockierserums ist eines dieser Protokolldetails, die ohne viel Nachdenken von Paper zu Paper übernommen werden – bis ein hoher Hintergrund auftritt, den Sie sich nicht erklären können. Die Spezies des Blockierserums zählt. Die Konzentration zählt. Die Hitzeinaktivierung zählt. Hier der vollständige Leitfaden.
Warum Blockierserum wirkt – der Mechanismus
Unspezifischer Hintergrund in IHC und Immunfluoreszenz hat vor allem zwei Ursachen:
- Bindung an Fc-Rezeptoren: Sekundärantikörper besitzen Fc-Regionen, die an Fc-Rezeptoren auf Makrophagen, dendritischen Zellen und anderen Immunzellen im Gewebeschnitt binden – das erzeugt ein unspezifisches Signal unabhängig von der Bindung des Primärantikörpers.
- Ladungsbedingte unspezifische Bindung: IgG-Moleküle sind bei physiologischem pH positiv geladen und können unspezifisch an negativ geladene Gewebebestandteile (Kollagen, Nukleinsäuren) binden.
Blockierserum sättigt Fc-Rezeptoren und unspezifische Bindungsstellen, bevor der Primärantikörper aufgetragen wird. Das IgG im Blockierserum besetzt diese Stellen – wenn der Sekundärantikörper hinzukommt, bleiben ihm nur die spezifischen Bindungsstellen am Primärantikörper.
Die Spezies-Regel – die wichtigste Entscheidung
Die Spezies des Blockierserums muss der Spezies entsprechen, in der Ihr Sekundärantikörper hergestellt wurde – nicht der Spezies des Primärantikörpers.
Beispiel: Primärantikörper = Kaninchen-Anti-Human-CD3 (im Kaninchen hergestellt). Sekundärantikörper = Esel-Anti-Kaninchen-IgG-AF488 (im Esel hergestellt). Blockierserum = normales Eselserum.
Die Logik: Ihr Sekundärantikörper wurde im Esel hergestellt und kreuzreagiert daher mit Esel-IgG. Blocken Sie mit Eselserum, besetzt das IgG im Blockierserum die unspezifischen Stellen. Kommt der Esel-Sekundärantikörper hinzu, kann er dort nicht binden, weil die Stellen bereits durch passendes Esel-IgG belegt sind.
Verwenden Sie zum Blocken die falsche Spezies (z. B. Ziegenserum bei einem Esel-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper), konkurriert das IgG im Blockierserum nicht mit dem Sekundärantikörper um die unspezifischen Bindungsstellen – der Hintergrund bleibt hoch.
Speziesauswahl – welches Serum für welchen Sekundärantikörper
| Sekundärantikörper hergestellt in | Richtiges Blockierserum | SeamlessBio-Produkt |
|---|---|---|
| Esel | Normales Eselserum (NDS) | Esel-Serum |
| Ziege | Normales Ziegenserum (NGS) | Ziegenserum |
| Kaninchen | Normales Kaninchenserum (NRS) | Kaninchenserum |
| Pferd | Normales Pferdeserum (NHS) | Pferdeserum |
| Schaf | Normales Schafserum (NSS) | Schafserum |
| Huhn | Normales Hühnerserum | Hühnerserum |
| Meerschweinchen | Normales Meerschweinchenserum (NGPS) | Meerschweinchen-Serum |
Warum Eselserum immer häufiger der Standard ist
Mehrfachmarkierungen in der Immunfluoreszenz – drei oder vier Antigene gleichzeitig mit spektral unterschiedlichen Fluorophoren – erfordern Sekundärantikörper aus verschiedenen Spezies, um Kreuzreaktivität zu vermeiden. Stammen alle Sekundärantikörper aus dem Esel (Esel-Anti-Kaninchen, Esel-Anti-Maus, Esel-Anti-Ziege), genügt ein einziger Blockierschritt mit normalem Eselserum. Das vereinfacht das Protokoll und vermeidet die bei Mehrfachfärbungen häufigen Fehler durch Spezieswechsel.
Da große Anbieter für speziesübergreifend kreuzadsorbierte Panels überwiegend im Esel hergestellte Sekundärantikörper anbieten, ist normales Eselserum das am häufigsten verwendete Blockierreagenz bei Mehrfachfärbungen in IHC und IF.
Standard-Blockierprotokoll
- Nach Antigendemaskierung und Permeabilisierung (falls erforderlich) überschüssigen Puffer abtropfen lassen – nicht abwaschen
- Blockierlösung auftragen: 5–10 % Normalserum in PBS (bzw. PBST für permeabilisierte Zellen) – 200–300 µl pro Schnitt oder Well
- Inkubieren 30–60 Minuten bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer
- Nicht waschen – überschüssige Blockierlösung durch Kippen des Objektträgers abtropfen lassen; das verbleibende Blockierserum hält die unspezifischen Stellen während der Inkubation mit dem Primärantikörper gesättigt
- Primärantikörper auftragen, verdünnt im selben Blockierpuffer (1–5 % Normalserum in PBS) – so bleiben die Blockierbedingungen während der gesamten Primärantikörper-Inkubation erhalten
Hitzeinaktivierung – nötig oder nicht?
Die Hitzeinaktivierung (56 °C, 30 min) zerstört die Komplementaktivität. Für das Blocken in IHC und IF wird sie empfohlen, wenn:
- die Gewebeschnitte intakte Komplementrezeptoren enthalten (frische Gefrierschnitte, bestimmte Zellpräparationen)
- Sie Komplementproteine färben – das Komplement des Blockierserums könnte mit Ihrem Primärantikörper konkurrieren
- das Protokoll hitzeinaktiviertes Normalserum vorschreibt – bei vielen kommerziellen Protokollen Standard
Bei routinemäßigen paraffineingebetteten FFPE-Schnitten ist die Hitzeinaktivierung nicht zwingend, beeinträchtigt die Blockierleistung aber nicht.
Konzentration – mehr ist nicht immer besser
5–10 % ist der Standardbereich. Höhere Konzentrationen (>20 %) können den Hintergrund erhöhen, weil überschüssiges IgG bei niedrigen Primärantikörperverdünnungen mit dem Primärantikörper um den Zugang zu den Antigenstellen konkurriert. Beginnen Sie bei Routineanwendungen mit 5 %; erhöhen Sie bei hohem Hintergrund auf 10 %, bevor Sie andere Protokollparameter ändern.
Erhältlich bei SeamlessBio
SeamlessBio liefert ein vollständiges Sortiment an Normalseren vom Tier zum Blocken in IHC/IF – alle sterilfiltriert (0,2 µm), mit vollständigem CoA:
- Normales Eselserum (NDS) – 50 ml, 100 ml, 500 ml
- Normales Ziegenserum (NGS) – 50 ml, 100 ml, 500 ml
- Normales Kaninchenserum (NRS) – 50 ml, 100 ml, 500 ml
- Normales Pferdeserum (NHS) – 50 ml, 100 ml, 500 ml
- Normales Schaf-, Hühner-, Meerschweinchenserum – 50 ml, 100 ml, 500 ml
Alle auf Anfrage auch hitzeinaktiviert erhältlich. → Tierseren-Portfolio ansehen
Weiterführende Literatur:
English
Deutsch