FKS-Dialyse-Protokoll: So stellen Sie dialysiertes fetales Kälberserum her

Standard-FKS enthält Glukose, Aminosäuren, Nukleotide, Vitamine und andere kleine Moleküle. Bei SILAC-Proteomik, ¹³C-Stoffflussanalyse, Metabolomik und Selektionssystemen auf Basis des Nukleotidstoffwechsels stören diese Moleküle: Sie verdünnen Isotopenmarkierungen oder überdecken den Metaboliten, den Sie messen wollen. Dialysiertes FKS ist von diesen kleinen Molekülen befreit, während Albumin, Wachstumsfaktoren und andere Proteine erhalten bleiben.

Dieses Protokoll beschreibt die Dialyse von FKS im Labor. Für größere Volumina und dokumentierte Chargen bietet SeamlessBio außerdem die Dialyse als Serumaufbereitungs-Dienstleistung. Hintergrund zu den Anwendungen: Was ist dialysiertes FKS?

So funktioniert die Serumdialyse

Das Serum wird in eine semipermeable Membran (Dialyseschlauch oder -kassette) gefüllt und in ein großes Puffervolumen getaucht.

• Moleküle, die kleiner sind als die Ausschlussgrenze der Membran (MWCO), diffundieren in den Puffer, bis sich die Konzentrationen angleichen.
• Größere Moleküle bleiben im Inneren: Albumin (ca. 66 kDa), Transferrin (ca. 80 kDa), IgG (ca. 150 kDa) und die meisten Wachstumsfaktoren.

Mehrmaliger Pufferwechsel senkt die kleinen Moleküle auf sehr niedrige Restgehalte.

Wahl der Ausschlussgrenze:
– 10 kDa ist die häufigste Wahl für dialysiertes FKS. Damit werden Aminosäuren, Glukose und Nukleotide zuverlässig entfernt.
– 3,5 kDa hält kleinere Peptide und kleine Proteine zurück, dauert aber länger.

Material

• FKS, z. B. FBS Standard oder FBS Premium, bei 2–8 °C aufgetaut
• Dialyseschläuche oder -kassetten, MWCO 10 kDa (alternativ 3,5 kDa)
• Dialysepuffer: sterile 0,9-%-NaCl-Lösung (0,15 M) oder PBS ohne Ca²⁺/Mg²⁺, auf 2–8 °C vorgekühlt
• Klemmen für Dialyseschläuche, großes Becherglas oder Gefäß, Magnetrührer
• Kühlraum oder Kühlschrank (2–8 °C)
• Filter: 0,45-µm-Vorfilter und 0,2-µm-Sterilfilter, geringe Proteinbindung (PES)

Schritt-für-Schritt-Anleitung

1. Membran vorbereiten

1. Den Dialyseschlauch auf Länge schneiden. Platz für Klemmen und für eine Volumenzunahme von etwa 10–20 % lassen.
2. Die Membran nach Herstellerangaben vorbereiten. Viele Membranen müssen in Wasser oder Puffer gespült oder eingeweicht werden, um Glycerin oder Konservierungsmittel zu entfernen.

2. Befüllen

3. Ein Ende des Schlauchs mit einer Klemme verschließen und mit dem aufgetauten Serum füllen.
4. Die meiste Luft entfernen, aber etwas Kopfraum lassen: Wegen der hohen Proteinkonzentration im Serum strömt während der Dialyse Wasser in den Schlauch.
5. Das zweite Ende verschließen.

3. Dialysieren

6. Den gefüllten Schlauch in mindestens das 50-fache seines Volumens an kaltem Puffer legen (z. B. 100 ml Serum in mindestens 5 l Puffer).
7. Langsam rühren bei 2–8 °C. Der Schlauch sollte frei schwimmen und darf nicht vom Rührfisch erfasst werden.
8. Puffer wechseln: 3–4-mal über 24–48 Stunden. Ein gängiger Plan ist nach 4 h, nach 8–12 h (über Nacht) und nach weiteren 12–24 h.

4. Ernten

9. Den Schlauch herausnehmen, außen kurz mit Puffer abspülen und ein Ende öffnen.
10. Das Serum in ein steriles Gefäß überführen und das Endvolumen notieren. Durch den Wassereinstrom ist das Serum nun etwas verdünnt.

5. Sterilfiltrieren

11. Über 0,45 µm vorfiltrieren, dann über 0,2 µm sterilfiltrieren. Die Dialyse ist kein steriler Schritt – diese Filtration ist vor der Zellkultur zwingend.

6. Aliquotieren und lagern

12. Aliquotieren und bei −20 °C lagern. Als „dialysiertes FKS“ mit MWCO, Datum und Charge beschriften.

7. Qualitätskontrolle

13. Glukose und bei SILAC die relevanten Aminosäuren (z. B. Arginin, Lysin) im dialysierten Serum messen. Sie sollten an oder nahe der Nachweisgrenze liegen.
14. Osmolalität und Gesamtprotein prüfen. Sie zeigen, ob eine Verdünnung oder ein Salzungleichgewicht korrigiert werden muss.
15. Das Wachstum Ihrer Zelllinie im fertigen Medium testen, bevor das Experiment beginnt.

Praktische Tipps

• Der Puffer bestimmt die Salzzusammensetzung. Die Dialyse gegen Ca²⁺/Mg²⁺-freies PBS entfernt auch freies Calcium und Magnesium aus dem Serum. Meist liefert das Kulturmedium diese Ionen.
• Medium ergänzen. Dialysiertem FKS fehlen Aminosäuren, Glukose und Nukleoside. Ihr Medium muss sie liefern – definiert oder für SILAC markiert.
• Mit langsamerem Wachstum rechnen. Manche Zelllinien wachsen in dialysiertem FKS langsamer. Eine leicht höhere Serumkonzentration oder eine schrittweise Adaption der Zellen kann helfen.
• Kalt arbeiten. Die Dialyse bei 2–8 °C verringert Proteinabbau und mikrobielles Wachstum während der langen Inkubation.

Anwendungen

• SILAC-Proteomik: entfernt unmarkiertes Arginin und Lysin, sodass die Zellen die schweren Isotope effizient einbauen.
• ¹³C-Stoffflussanalyse und Metabolomik: entfernt Hintergrund an Glukose, Glutamin und anderen Metaboliten.
• Selektionssysteme: zum Beispiel HAT und andere Selektionen auf Basis des Nukleotidstoffwechsels, bei denen Serumnukleoside stören.
• Studien zur Aufnahme von Nährstoffen und Arzneistoffen: definierte Konzentrationen kleiner Moleküle im Medium.

Häufig gestellte Fragen

Was ist dialysiertes FKS?
FKS, aus dem kleine Moleküle (Aminosäuren, Glukose, Nukleotide, Vitamine) per Dialyse entfernt wurden, während Proteine wie Albumin und Wachstumsfaktoren erhalten bleiben. Siehe Was ist dialysiertes FKS?

Welche Ausschlussgrenze sollte ich für die FKS-Dialyse verwenden?
10 kDa ist die häufigste Wahl. Eine 3,5-kDa-Membran hält mehr kleine Proteine und Peptide zurück, dauert aber länger.

Wie lange dauert die FKS-Dialyse?
Typischerweise 24–48 Stunden bei 2–8 °C mit 3–4 Pufferwechseln.

Entfernt die Dialyse Hormone aus dem Serum?
Teilweise. Freie kleine Hormone können die Membran passieren, viele Steroid- und Schilddrüsenhormone sind aber an Proteine wie Albumin gebunden und bleiben im Serum. Um gezielt Hormone zu entfernen, verwenden Sie die Aktivkohlebehandlung.

Ist dialysiertes FKS steril?
Nur wenn es nach der Dialyse sterilfiltriert wird. Die Dialyse selbst ist kein steriler Prozess.

Kann ich dialysiertes FKS kaufen, statt es selbst herzustellen?
Ja. SeamlessBio dialysiert FKS und andere Seren auf Anfrage im Rahmen unserer Serumaufbereitung als Dienstleistung, ab 100 ml. Preise und Lieferzeiten auf Anfrage – Angebot anfordern.

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