Hitzeinaktivierung von FKS und Serum: Schritt-für-Schritt-Protokoll bei 56 °C

Die Hitzeinaktivierung zerstört die Aktivität des Komplementsystems im Serum. Sie wird eingesetzt, wenn Komplement einen Assay stören oder Zellen schädigen würde – etwa in immunologischen Assays, bei manchen Immunzellkulturen und bei vielen antikörperbasierten Tests. Die Standardbedingung ist 30 Minuten bei 56 °C.

Dieses Protokoll beschreibt, wie Sie fetales Kälberserum (FKS), Menschliches Serum und andere Seren im Labor korrekt hitzeinaktivieren. Ob Ihre Anwendung überhaupt hitzeinaktiviertes Serum braucht, wird hier besprochen: Hitzeinaktivierung von Serum: notwendig oder Gewohnheit?

Was die Hitzeinaktivierung bewirkt – und was nicht

Sie bewirkt:
– die Zerstörung der Komplementaktivität. Mehrere Komplementkomponenten, besonders C1, verlieren bei 56 °C innerhalb von Minuten ihre Aktivität.

Sie bewirkt nicht:
– eine Sterilisation des Serums
– die Entfernung von Mykoplasmen
– eine zuverlässige Virusinaktivierung

Dafür sorgen Sterilfiltration, Prüfungen und bei Bedarf Gammabestrahlung.

Sie hat auch einen Preis: hitzeempfindliche Wachstumsfaktoren und andere Proteine werden teilweise abgebaut. Hitzeinaktiviertes Serum kann das Wachstum daher etwas schlechter unterstützen als unbehandeltes.

Material

• Gefrorenes Serum in der Originalflasche, z. B. FKS oder Humanserum
• Wasserbad mit Thermostat, auf 56 °C eingestellt, groß genug für die Flasche
• Eine Referenzflasche gleicher Größe und Art, mit demselben Volumen Wasser gefüllt
• Kalibriertes Thermometer oder Temperaturfühler
• Timer
• Eisbad oder Kühlschrank (2–8 °C) zum Abkühlen
• Sterile Röhrchen für Aliquots

Schritt-für-Schritt-Anleitung

1. Serum auftauen

1. Das Serum langsam auftauen bei 2–8 °C, z. B. über Nacht im Kühlschrank.
   • Alternativ: bei Raumtemperatur, die Flasche herausnehmen, sobald sie gerade aufgetaut ist.
   • Nie bei 37 °C oder 56 °C auftauen. Lokale Überhitzung führt zu Proteinaggregation und Niederschlag.
2. Durch mehrmaliges vorsichtiges Schwenken der Flasche mischen, nicht schütteln. Beim Auftauen konzentrieren sich Proteine und Salze am Flaschenboden.

2. Wasserbad vorbereiten

3. Das Wasserbad vorheizen auf 56 °C und die Temperatur mit einem kalibrierten Thermometer prüfen.
4. Der Wasserstand muss über dem Serumspiegel in der Flasche liegen, aber unter dem Verschluss.
5. Die Referenzflasche mit demselben Wasservolumen und einem Thermometer neben die Serumflasche ins Bad stellen.

3. Erhitzen

6. Die Serumflasche ins Wasserbad stellen.
7. Die Zeitmessung erst starten, wenn die Referenzflasche 56 °Cerreicht – nicht beim Einstellen der Flasche. Eine 500-ml-Flasche kann 15–30 Minuten oder länger brauchen, um 56 °C zu erreichen.
8. Halten bei 30 Minuten bei 56 °C.
9. Die Flasche alle 5–10 Minuten vorsichtig schwenken, damit die Temperatur gleichmäßig bleibt.
10. Die Temperatur nicht über 56 °C steigen lassen. Höhere Temperaturen verstärken Proteindenaturierung und Trübung.

4. Abkühlen

11. Direkt nach den 30 Minuten die Flasche aus dem Wasserbad nehmen und im Eisbad oder bei 2–8 °C schnell abkühlen.

5. Aliquotieren und lagern

12. Das Serum aseptisch in geeignete Volumina aliquotieren.
13. Als „HI“ (hitzeinaktiviert) mit Datum und Charge beschriften.
14. Bei −20 °C lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.

Typische Fehler

Fehler	Folge
Zeitmessung beginnt beim Einstellen der Flasche ins Wasserbad	Das Serum ist deutlich kürzer als 30 min bei 56 °C; Komplement kann aktiv bleiben
Wasserbad über 56 °C oder deutlich länger als 30 min erhitzt	Mehr Proteinaggregation, Niederschlag, Verlust wachstumsfördernder Faktoren
Auftauen bei 37 °C oder 56 °C	Proteinaggregation; das Serum wird zweimal erwärmt
Kein Mischen beim Erhitzen	Ungleichmäßige Erwärmung in der Flasche
Hitzeinaktivierung als „Sicherheitsschritt“	Falsches Sicherheitsgefühl; Viren und Mykoplasmen werden nicht zuverlässig inaktiviert
Wiederholte Hitzeinaktivierung desselben Serums	Zusätzlicher Abbau ohne jeden Nutzen

Niederschlag nach der Hitzeinaktivierung

Leichte Trübung oder feine Flocken nach der Hitzeinaktivierung sind häufig. Sie bestehen überwiegend aus denaturierten Lipoproteinen und Fibrinogenresten und beeinträchtigen die Zellkulturleistung in der Regel nicht. Stört der Niederschlag bei Mikroskopie oder Durchflusszytometrie, können Sie das Serum kurz zentrifugieren oder filtrieren. Die Filtration von viskosem Serum über 0,2 µm kann langsam sein; siehe Sterilfiltration 0,1 µm vs. 0,2 µm.

Hitzeinaktivierung von Humanserum

Humanserum wird auf dieselbe Weise hitzeinaktiviert (56 °C, 30 Minuten). Besonders üblich ist das für:
– immunologische Assays und T-Zell-Kulturen mit Humanserum
– Assays, in denen eine komplementvermittelte Lyse das Ergebnis verfälschen würde

Siehe Humanserum für PBMC und Immunoassays.

Gebrauchsfertiges hitzeinaktiviertes Serum

Wenn Sie über viele Experimente hinweg eine gleichbleibende, dokumentierte Hitzeinaktivierung brauchen, verwenden Sie ein vorbehandeltes Produkt:
– FBS hitzeinaktiviert – US-amerikanische, australische oder südamerikanische Herkunft
– Durch Hitze inaktiviertes Humanserum – gemischte Spender, EU- oder US-Herkunft
– Hitzeinaktivierung anderer Seren ab 50 ml als Serumaufbereitung als Dienstleistung

Häufig gestellte Fragen

Warum 30 Minuten bei 56 °C?
Bei 56 °C verlieren die hitzelabilen Komplementkomponenten (besonders C1) innerhalb von Minuten ihre Aktivität. Dreißig Minuten sind ein sicherer Puffer. Höhere Temperaturen oder längere Zeiten schädigen mehr Proteine ohne zusätzlichen Nutzen.

Muss ich FKS hitzeinaktivieren?
Nicht standardmäßig. Die meisten modernen FKS-Chargen haben eine geringe Komplementaktivität, und viele Zelllinien wachsen in unbehandeltem FKS genauso gut oder besser. Hitzeinaktivieren Sie, wenn Komplement Ihren Assay oder Ihre Zellen stören könnte. Siehe Hitzeinaktivierung: notwendig oder Gewohnheit?

Tötet die Hitzeinaktivierung Mykoplasmen oder Viren ab?
Nein, nicht zuverlässig. Mykoplasmen werden durch Filtration und Prüfung beherrscht, Viren durch Spender-/Herdenauswahl, Prüfung und bei Bedarf Gammabestrahlung.

Woher weiß ich, dass das Serum wirklich 56 °C erreicht hat?
Verwenden Sie eine Referenzflasche gleicher Größe und gleichen Volumens mit Thermometer und starten Sie die 30 Minuten erst, wenn sie 56 °C erreicht.

Ist der Niederschlag nach der Hitzeinaktivierung ein Problem?
Meist nicht. Leichte Trübung entsteht durch denaturierte Lipoproteine und beeinträchtigt die meisten Zellkulturen nicht.

Kann hitzeinaktiviertes Serum wieder eingefroren werden?
Ja, nach dem Aliquotieren. Weitere Einfrier-/Auftauzyklen desselben Aliquots vermeiden.

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