Protokoll zur Aktivkohlebehandlung von FKS: So stellen Sie hormonabgereichertes Serum her

Fetales Kälberserum enthält Steroid- und Schilddrüsenhormone, Vitamine und andere lipophile Moleküle. Für Studien zur Östrogen-, Androgen-, Glukokortikoid- oder Schilddrüsenhormon-Signalgebung müssen diese Hintergrundhormone entfernt werden, sonst lässt sich die Wirkung des zugesetzten Hormons nicht sauber messen. Die Standardmethode ist die Behandlung mit dextranbeschichteter Aktivkohle (DCC), die sogenannte Aktivkohlebehandlung (Charcoal Stripping).

Dieses Protokoll beschreibt eine verbreitete Labormethode. Wenn Sie größere Volumina oder gleichbleibende, dokumentierte Chargen benötigen, bietet SeamlessBio einfache und doppelte Aktivkohlebehandlung als Serumaufbereitungs-Dienstleistung.

Was die Aktivkohlebehandlung entfernt – und was nicht

Aktivkohle adsorbiert kleine, lipophile Moleküle. Die Dextranbeschichtung deckt die Poren teilweise ab, sodass große Proteine wie Albumin, Immunglobuline und die meisten Wachstumsfaktoren im Serum bleiben.

Durch die Aktivkohlebehandlung reduziert:
– Steroidhormone (Östradiol, Progesteron, Testosteron, Cortisol)
– Schilddrüsenhormone (T3, T4)
– lipophile Vitamine und Retinoide
– einige Lipide, Fettsäuren und lipophile Arzneistoffrückstände
– auch einige Wachstumsfaktoren, in geringerem Ausmaß

Weitgehend erhalten:
– Albumin, Transferrin, Immunglobuline
– die meisten hochmolekularen Proteine

Aktivkohlebehandlung vs. Delipidierung: Die Delipidierung entfernt Lipide, lässt aber Steroidhormone im Serum. Wenn Sie lipidabgereichertes Serum mit intakten Hormonen benötigen, ist die Delipidierung die bessere Wahl. Für humane Matrices siehe Delipidiertes Humanserum.

Material

• FKS, z. B. FBS Standard oder FBS Premium, bei 2–8 °C aufgetaut
• Aktivkohle, säuregewaschen, für Zellkultur oder in Analysenqualität
• Dextran, mittlere Molmasse ca. 70 kDa (Dextran T-70)
• Puffer für die DCC-Suspension, z. B. 10 mM HEPES oder Tris-HCl pH 7,4 mit 0,25 M Saccharose und 1,5 mM MgCl₂
• Zentrifuge und für das Volumen geeignete Röhrchen oder Flaschen
• Wasserbad mit 56 °C (nur für die stringente Variante)
• Filter: 0,45-µm-Vorfilter und 0,2-µm-Sterilfilter, geringe Proteinbindung (PES)

Schritt-für-Schritt-Anleitung

1. DCC-Suspension herstellen (am Vortag)

1. Eine Suspension aus 0,25 % (w/v) Aktivkohle und 0,025 % (w/v) Dextran T-70 in Puffer herstellen. Beispiel: 2,5 g Aktivkohle + 0,25 g Dextran in 1 l Puffer.
2. Über Nacht bei 2–8 °C rühren, damit das Dextran die Aktivkohle beschichtet.

2. Aktivkohle pelletieren

3. Ein Volumen DCC-Suspension, das dem Volumen des zu behandelnden Serums entspricht, in ein Zentrifugenröhrchen oder eine Flasche überführen.
4. Zentrifugieren bei etwa 500 × g für 10 Minuten. Den Überstand vorsichtig abnehmen und verwerfen. Das Aktivkohlepellet bleibt im Röhrchen.

3. Erste Behandlungsrunde

5. Das aufgetaute Serum auf das Aktivkohlepellet geben und durch Vortexen oder Schütteln vollständig resuspendieren.
6. Unter sanftem, kontinuierlichem Mischen inkubieren. Eine Variante wählen:
   • Schonend: 12–16 Stunden (über Nacht) bei 2–8 °C
   • Stringent: 45 Minuten bei 56 °C. Dabei wird das Serum zugleich hitzeinaktiviert (siehe Protokoll zur Hitzeinaktivierung).
7. Zentrifugieren bei etwa 500–1.000 × g für 10–15 Minuten und das Serum in ein neues Röhrchen mit einem frischen Aktivkohlepellet überführen (hergestellt wie in Schritt 2).

4. Zweite Behandlungsrunde

8. Erneut resuspendieren und mit derselben Variante wie in Runde 1 inkubieren. Eine zweite Runde senkt die Resthormonspiegel deutlich. „Doppelt aktivkohlebehandeltes“ Serum wird zweimal behandelt.

5. Aktivkohle entfernen

9. Bei höherer Drehzahl zentrifugieren, z. B. 2.000–3.000 × g für 20 Minuten, um die Aktivkohle möglichst vollständig zu entfernen.
10. Das Serum über 0,45 µm vorfiltrieren, dann über 0,2 µm sterilfiltrieren. Feine Kohlepartikel verstopfen Filter schnell – planen Sie mehrere Vorfilter ein.

6. Aliquotieren und lagern

11. Das behandelte Serum aliquotieren und bei −20 °C lagern. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Als „aktivkohlebehandelt“ mit Datum und Charge beschriften.

7. Qualitätskontrolle

12. Die Zielhormone (z. B. Östradiol, Testosteron, Cortisol) vor und nach der Behandlung per Immunoassay oder LC-MS/MS messen. Jedes Labor legt seinen akzeptablen Restgehalt selbst fest.
13. Wachstum testen: Behandeltes Serum unterstützt das Zellwachstum schlechter als unbehandeltes. Vergleichen Sie Wachstum und Morphologie Ihrer Zelllinie, bevor Sie das Serum in Experimenten einsetzen.

Praktische Tipps

• Medium ohne Phenolrot verwenden für Östrogenstudien. Phenolrot hat eine schwache östrogene Wirkung und hebt einen Teil des Nutzens der Behandlung wieder auf.
• Serum richtig auftauen: über Nacht bei 2–8 °C, nicht bei 37 °C oder wärmer.
• Bedingungen konstant halten innerhalb einer Studie. Aktivkohletyp, Inkubationszeit und Anzahl der Runden beeinflussen das Ergebnis.
• Serumfreie Systeme in Betracht ziehen: Wenn Ihr Ziel ein definierter, hormonfreier Hintergrund ist, kann ein serumfreies Medium eine Alternative zu behandeltem Serum sein.

Häufig gestellte Fragen

Wofür wird aktivkohlebehandeltes FKS eingesetzt?
Für Experimente, in denen Steroid- oder Schilddrüsenhormone im Serum die Wirkung zugesetzter Hormone überdecken würden. Typische Beispiele sind Östrogen- und Androgenrezeptor-Assays, Glukokortikoidstudien, Kernrezeptor-Reporterassays und die Herstellung steroidfreier Kalibratormatrices.

Was ist der Unterschied zwischen einfacher und doppelter Aktivkohlebehandlung?
Einfache Behandlung bedeutet eine Inkubation mit Aktivkohle; doppelte Behandlung zwei aufeinanderfolgende Inkubationen mit frischer Aktivkohle. Die doppelte Behandlung ergibt niedrigere Resthormonspiegel.

Warum ist die Aktivkohle mit Dextran beschichtet?
Die Dextranschicht deckt die Poren der Aktivkohle teilweise ab. Kleine Moleküle wie Steroide werden weiterhin adsorbiert, während große Proteine wie Albumin im Serum bleiben.

Verändert die Aktivkohlebehandlung die Wachstumseigenschaften des Serums?
Ja, meist wachsen die Zellen etwas langsamer, weil Hormone, Vitamine und einige Wachstumsfaktoren entfernt werden. Testen Sie Ihre Zelllinie, bevor Sie eine neue behandelte Charge einsetzen.

Soll ich vor oder nach der Aktivkohlebehandlung hitzeinaktivieren?
Bei der stringenten Variante mit 56 °C wird das Serum während der Behandlung hitzeinaktiviert. Bei der schonenden Variante mit 2–8 °C inaktivieren Sie separat, falls Ihr Assay es erfordert.

Kann SeamlessBio Serum für mich mit Aktivkohle behandeln?
Ja. Einfache und doppelte Aktivkohlebehandlung von FKS und anderen Seren gehören zu unserer Serumaufbereitung als Dienstleistung, ab 100 ml. Preise und Lieferzeiten auf Anfrage – Angebot anfordern.

Verwandte Themen: Dienstleistungen zur Serumaufbereitung · Fötales Kälberserum (FKS) · Delipidiertes Humanserum · FKS-Dialyse-Protokoll · Serumfreie Systeme