Protokoll zur PBMC-Isolierung: Dichtegradientenzentrifugation mit einem Lymphozyten-Separationsmedium

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) – Lymphozyten und Monozyten – sind das Ausgangsmaterial für Immunphänotypisierung, T-Zell-Assays, ELISpot, Zytokinfreisetzungs-Assays und viele Zelltherapie-Workflows. Am häufigsten werden sie per Dichtegradientenzentrifugation über ein Lymphozyten-Separationsmedium mit 1,077 g/ml isoliert.

Dieses Protokoll beschreibt das Standardverfahren für frisches, antikoaguliertes humanes Vollblut mit Lymphobio, einer gebrauchsfertigen Lymphozyten-Separationslösung mit 1,077 g/ml.

So funktioniert die Dichtegradiententrennung

Das Separationsmedium ist eine Lösung auf Polysaccharose-Basis, eingestellt auf eine Dichte von 1,077 g/ml bei 20 °C. Bei der Zentrifugation:

• Erythrozyten und Granulozyten sind dichter als 1,077 g/ml. Sie sedimentieren durch das Medium auf den Boden des Röhrchens. Erythrozyten aggregieren im Medium, was ihre Sedimentation beschleunigt.
• Mononukleäre Zellen (Lymphozyten, Monozyten) sind weniger dicht. Sie sammeln sich als weißliche Bande an der Grenzfläche zwischen Plasma und Medium.
• Plasma und die meisten Thrombozyten bleiben in der oberen Schicht.

Die Methode hängt von korrekter Dichte, Temperatur und einem ungestörten Gradienten ab. Die meisten misslungenen Isolierungen gehen auf einen dieser drei Punkte zurück.

Material

• Frisches humanes Vollblut mit Antikoagulans (EDTA, Natriumheparin oder Citrat)
• Lymphobio Lymphozyten-Separationslösung, 1,077 g/ml, auf 18–20 °C temperiert
• Steriles PBS ohne Ca²⁺/Mg²⁺ (zum Waschen optional mit 2 mM EDTA und/oder 0,5–2 % Serum oder Albumin)
• Sterile konische 15-ml- oder 50-ml-Röhrchen, serologische Pipetten, Pasteurpipetten
• Zentrifuge mit Ausschwingrotor, Temperaturregelung und abschaltbarer Bremse
• Trypanblau und ein Zellzähler oder eine Zählkammer
• Sicherheitswerkbank (Klasse II) und geeignete PSA

Biosicherheit: Behandeln Sie jedes Humanblut als potenziell infektiös und arbeiten Sie nach den Regeln Ihrer Einrichtung unter BSL-2-Bedingungen.

Schritt-für-Schritt-Anleitung

1. Reagenzien vorbereiten

1. Separationsmedium, PBS und Blut auf Raumtemperatur (18–20 °C) bringen. Die Dichte des Mediums ist bei 20 °C spezifiziert. Kälteres oder wärmeres Medium verändert die Trennung.
2. Das Separationsmedium durch vorsichtiges Schwenken der Flasche mischen. Aseptisch arbeiten.

2. Blut verdünnen

3. Das Blut 1:1 mit PBS verdünnen (z. B. 15 ml Blut + 15 ml PBS) und vorsichtig mischen. Die Verdünnung verringert Zellaggregation und den Einschluss von Lymphozyten im Erythrozytenpellet.

3. Blut auf das Medium schichten

4. Separationsmedium in ein konisches Röhrchen geben:
   • 50-ml-Röhrchen: 15 ml Medium
   • 15-ml-Röhrchen: 3–4 ml Medium

5. Das Röhrchen schräg halten und das verdünnte Blut langsam auf das Medium schichten. An der Röhrchenwand herunterlaufen lassen, damit sich die beiden Phasen nicht mischen:

   • 50-ml-Röhrchen: bis zu 30–35 ml verdünntes Blut
   • 15-ml-Röhrchen: bis zu 8 ml verdünntes Blut

   Eine scharfe Grenze zwischen der roten Schicht und dem klaren Medium sollte sichtbar bleiben.

4. Zentrifugieren

6. Zentrifugieren bei 400 × g für 30–40 Minuten bei 18–20 °C im Ausschwingrotor.
   • Beschleunigung: niedrig
   • Bremse: aus. Eine Bremse stört die Grenzfläche und vermischt die Schichten.

5. PBMC-Schicht ernten

7. Nach der Zentrifugation sehen Sie von oben nach unten:
   • Plasma
   • eine weißliche, trübe PBMC-Bande
   • klares Separationsmedium
   • ein rotes Pellet aus Erythrozyten und Granulozyten
8. Einen Teil der oberen Plasmaschicht mit einer Pipette abnehmen, ohne die PBMC-Bande zu berühren. Wenn Sie autologes Plasma benötigen, aufbewahren.
9. Die PBMC-Bande mit einer sterilen Pasteurpipette abnehmen und in ein neues Röhrchen überführen. Möglichst wenig Separationsmedium mitnehmen – Restmedium senkt die Viabilität und macht das Waschen weniger effektiv.

6. Zellen waschen

10. Mindestens das 3-fache Volumen PBS zu den geernteten Zellen geben (z. B. im 50-ml-Röhrchen auf 40–50 ml auffüllen) und vorsichtig mischen.
11. Zentrifugieren bei 300 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, Bremse an. Überstand verwerfen.
12. Pellet in PBS resuspendieren und erneut zentrifugieren bei 200 × g für 10–15 Minuten. Die niedrigere Drehzahl entfernt die meisten verbliebenen Thrombozyten mit dem Überstand.
13. Optional: Ist das Pellet sichtbar rot, eine kurze Erythrozytenlyse mit einem Ammoniumchlorid-Puffer durchführen und noch einmal waschen.

7. Zählen und Viabilität bestimmen

14. Die Zellen in Kulturmedium oder Puffer resuspendieren und mit Trypanblau zählen.
    • Viabilität: bei frischem Blut gesunder Spender typischerweise über 90–95 %.
    • Ausbeute: typischerweise 0,5–2 × 10⁶ PBMC pro ml Vollblut – abhängig von Spender, Antikoagulans und Zeit bis zur Verarbeitung.

8. Verwenden oder kryokonservieren

15. Die Zellen sofort verwenden oder kryokonservieren:
    • Einfriermedium: 90 % Serum mit 10 % DMSO. Für Workflows ohne bovines Material verwenden Sie Humanserum oder humanes AB-Serum statt FKS.
    • Einfrieren: langsam, mit etwa −1 °C/min.
    • Lagerung: in der Dampfphase von flüssigem Stickstoff.

Kultur nach der Isolierung

Für T-Zell-, NK-Zell- und Monozytenassays verwenden viele Labore Humanserum statt FKS. Das vermeidet eine xenogene Hintergrundstimulation.

• AB-Serum: Serum vom Typ AB enthält keine Anti-A- oder Anti-B-Isoagglutinine und kann mit Zellen von Spendern jeder Blutgruppe verwendet werden. Siehe Humanserum für PBMC und Immunoassays und die Anwendungsseite PBMC & Immunologie.
• Hitzeinaktiviertes Serum: Wenn Komplementaktivität Ihren Assay stören würde, verwenden Sie hitzeinaktiviertes Humanserum.

Fehlerbehebung

Varianten

• Buffy Coats und Leukaphereseprodukte enthalten deutlich mehr Zellen pro ml. Vor dem Überschichten stärker verdünnen (oft 1:2 bis 1:4 mit PBS), damit der Gradient nicht überladen wird.
• Separationsröhrchen mit porösem Einsatz erlauben die Blutzugabe ohne vorsichtiges Überschichten. Befolgen Sie die Herstellerangaben zu Volumina, Drehzahl und Bremseinstellung.
• Andere Spezies: 1,077 g/ml ist für humane Zellen optimiert. Maus und einige andere Spezies benötigen eine andere Dichte.

Häufig gestellte Fragen

Welche Dichte sollte ein Lymphozyten-Separationsmedium für humane PBMC haben? 1,077 g/ml bei 20 °C. Das ist die Standarddichte zur Trennung humaner mononukleärer Zellen von Granulozyten und Erythrozyten.

Sind Dichtegradientenmedien auf Polysucrose-Basis austauschbar? Dichtegradientenmedien auf Polysucrose-Basis mit 1,077 g/ml beruhen alle auf demselben Prinzip und demselben Protokoll. Lymphobio ist als direkter Ersatz in bestehenden Protokollen ausgelegt.

Warum muss die Zentrifugenbremse aus sein? Das Abbremsen des Rotors wirbelt die Grenzfläche auf. Die PBMC-Bande vermischt sich dann mit Medium und Erythrozyten, Ausbeute und Reinheit sinken.

Welches Antikoagulans eignet sich am besten für die PBMC-Isolierung? EDTA, Heparin und Citrat funktionieren alle. Wählen Sie nach dem nachfolgenden Assay. Heparin kann zum Beispiel manche PCR-basierten Methoden stören. EDTA-Blut ist in der Durchflusszytometrie üblich.

Wie lange kann Blut vor der PBMC-Isolierung gelagert werden? So schnell wie möglich verarbeiten, idealerweise innerhalb weniger Stunden bei Raumtemperatur. Bei längerer Lagerung ändern Granulozyten ihre Dichte und kontaminieren die PBMC-Fraktion, und die Viabilität sinkt.

Kann ich PBMC in Humanserum statt FKS einfrieren? Ja. Viele Immunologielabore verwenden Humanserum oder humanes AB-Serum mit 10 % DMSO, um bovine Proteine in späteren Assays zu vermeiden.

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