Kurzdefinition

Was ist ein vesikulärer Transportassay? Ein vesikulärer Transportassay ist eine In-vitro-Methode zur Messung der Aktivität von ABC-Transportern mit Inside-out-Membranvesikeln – geschlossenen Membranfragmenten, bei denen die zytoplasmatische Seite des Transporters nach außen zeigt. Nach Zugabe von ATP pumpt der Transporter sein Substrat ins Vesikelinnere; so lassen sich die Substratanreicherung direkt quantifizieren und der Inhibitor-IC50 bestimmen.

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Warum inside-out?

Bei ABC-Effluxtransportern in lebenden Zellen zeigt die Substratbindungsstelle zum Zytoplasma – von außen ist sie nicht zugänglich. Um den Transporter direkt zu untersuchen, muss die Membran umgestülpt werden. In Inside-out-Vesikeln zeigt die Bindungsstelle zum Inkubationspuffer, sodass die Testsubstanz mit dem Transporter interagieren kann, ohne zuerst eine Zellmembran zu überwinden. Damit fällt die passive Permeabilität als Störgröße weg – die größte Einschränkung zellbasierter Transportassays bei lipophilen Substanzen.

Vesikulärer Transport vs. zellbasierter Assay

Zellbasierte bidirektionale Transportassays (Caco-2, MDCKII-MDR1) messen die Effluxrate einer Substanz über einen Zellmonolayer. Bei hochpermeablen Substanzen dominiert die passive Diffusion, und die Effluxrate fällt Richtung 1,0 – der aktive Efflux wird überdeckt. Der vesikuläre Transportassay hat diese Einschränkung nicht, weil keine Membran überwunden werden muss, um die Bindungsstelle des Transporters zu erreichen.

Gebrauchsfertige Vesikelkits

Die Cell4Pharma-Vesikelkits für ABC-Transporter (in der DACH-Region vertrieben von SeamlessBio) liefern vorgefertigte, QC-validierte Inside-out-Membranvesikel für DMPK-Transportertests im eigenen Labor – für BSEP, P-gp, BCRP, MRP1–MRP5, MRP8 sowie Kontrollvesikel. 100 Reaktionen pro Kit, Lagerung bei −80 °C.

Wichtige Fakten

Inside-out-Vesikel werden aus Zellen (Sf9-Insektenzellen oder HEK293) hergestellt, die einen bestimmten ABC-Transporter überexprimieren – bei der Herstellung stülpt sich die Membran um, sodass die Substratbindungsstelle nach außen zeigt
ATP-abhängige Substratanreicherung in den Vesikeln = spezifische Transporteraktivität; AMP-Kontrolle = unspezifischer Hintergrund
Zum Assayzeitpunkt ist keine Zellkultur nötig – die Vesikel werden bei −80 °C gelagert und bei Bedarf aufgetaut
Die passive Permeabilität der Testsubstanz beeinflusst den Assay nicht – ein entscheidender Vorteil gegenüber zellbasierten Assays bei hochpermeablen Substanzen
Die einzige praktikable Methode für BSEP, MRP2, MRP3, MRP4, MRP5, MRP8 – für diese Transporter gibt es kein Standard-Zellmonolayermodell
Ergebnisse am selben Tag – typische Inkubation 5–30 Minuten je Transporter
Von FDA, EMA und ICH M12 für die Bestimmung des DDI-Inhibitor-IC50 akzeptiert

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Was ist ein Vesikeltransport-Assay?