Die Vitamin-D-Untersuchung gehört weltweit zu den am häufigsten durchgeführten klinisch-chemischen Tests. Jährlich werden mehrere zehn Millionen 25-Hydroxyvitamin-D-Tests auf automatisierten Immunoassay-Plattformen durchgeführt – und jedes dieser Testkits benötigt eine Kalibriermatrix, aus der Vitamin D auf Hintergrundniveau reduziert wurde. Bei dieser Matrix handelt es sich um Human Processed Serum (HPS) ohne Vitamin D.
In diesem Leitfaden wird erläutert, was es ist, wie es hergestellt wird, warum die menschliche Matrix für die Genauigkeit des Assays von Bedeutung ist und worauf bei der Beschaffung für die IVD-Herstellung zu achten ist.
Was ist Vitamin-D-abgereichertes Human-Processed-Serum (HPS)?
Vitamin-D-abgereichertes humanes verarbeitetes Serum (HPS) ist gepooltes Humanserum, das einer Aktivkohle-Strippung unterzogen wurde, um endogenes 25-Hydroxyvitamin D (25-OH-D₂ und 25-OH-D₃) sowie 1,25-Dihydroxyvitamin D auf Restkonzentrationen unter 4 ng/ml reduziert wurde – diese Werte sind auf Standard-Immunoassay-Plattformen in der Regel nicht nachweisbar.
Das Produkt wird in der IVD-Branche und in der wissenschaftlichen Literatur auch unter verschiedenen alternativen Bezeichnungen geführt:
- Vitamin-D-freies Humanserum — von US-amerikanischen Lieferanten, darunter Golden West Biologicals, verwendete Terminologie
- Von Vitamin D befreites Humanserum — häufig in Protokollen für klinische Studien und zur Methodenentwicklung
- Serum mit Aktivkohle (Vitamin D) — Beschreibung des Verarbeitungsverfahrens
- Serum mit vermindertem 25-OH-D-Gehalt — analytspezifischer Deskriptor
- HPS Vitamin-D-Mangel — SEQENS IVD / Avantor-Nomenklatur, der präziseste Fachbegriff für IVD
Unabhängig von der in Ihrer Spezifikation oder Ihrem technischen Dossier verwendeten Terminologie beschreiben diese Produkte dieselbe Matrix – menschliches Serum, aus dem Vitamin D so weit entfernt wurde, dass es unterhalb der Nachweisgrenze des Assays liegt.
Warum Humanserum – und kein Puffer oder keine synthetische Matrix?
Die Wahl der Matrix für Vitamin-D-Kalibratoren ist nicht willkürlich. Menschliches Serum ist aus zwei Gründen die bevorzugte – und in vielen Fällen vorgeschriebene – Grundmatrix.
Vitamin-D-bindendes Protein (DBP) und Albumin. Im menschlichen Serum sind etwa 85% des zirkulierenden 25-OH-D an das Vitamin-D-bindende Protein (DBP) und etwa 15% an Albumin gebunden. Nur 0,03% ist wirklich frei. Die meisten Immunoassay-Plattformen verwenden Antikörper oder DBP-kompetitive Formate, die mit dem gesamten Vitamin D – sowohl gebundenem als auch freiem – interagieren. Werden Kalibratoren in Puffer statt in Humanserum hergestellt, fehlt der DBP-Hintergrund, und die Assay-Reaktion auf zugesetztes Vitamin D unterscheidet sich von der Reaktion in Patientenproben. Dies führt zu einem systematischen Kalibrierungsfehler über den gesamten klinischen Bereich hinweg.
Durch die Herstellung von Kalibratoren aus Vitamin-D-armem Humanserum bleiben der DBP- und der Albumin-Hintergrund erhalten – dadurch wird sichergestellt, dass die Kalibratormatrix mit der Patientenprobenmatrix übereinstimmt, und die methodenübergreifende Verzerrung wird minimiert.
Anforderungen an die IVDR-Matrix. Gemäß den Leistungsanforderungen in Anhang I der Richtlinie IVDR müssen Hersteller nachweisen, dass die Leistungsfähigkeit des Assays in einer für die vorgesehene Probenart repräsentativen Matrix nachgewiesen wurde. Für Vitamin-D-Assays auf Serumbasis bedeutet dies, dass die Kalibratoren in einer Matrix aus menschlichem Serum hergestellt werden müssen – nicht in Puffer oder tierischem Serum. Als Standardlösung dient Vitamin-D-abgereichertes menschliches Serum.
Wie wird Vitamin-D-armes Serum hergestellt?
Der Herstellungsprozess für HPS-Vitamin-D-abgereichertes Vitamin D umfasst zwei Hauptschritte.
Schritt 1 – Entfettung. Das gepoolte Humanserum wird mit Dextransulfat und Magnesiumchlorid oder Calciumchlorid behandelt, wodurch Lipoproteine (VLDL, LDL, HDL) ausfallen. Das Serum wird zentrifugiert und filtriert, wodurch Lipide entfernt werden, die andernfalls eine Trübung verursachen und die photometrischen Messungen beeinträchtigen würden. Da der größte Teil des Vitamin D an Lipoproteinfraktionen gebunden ist, führt die Entfettung auch zu einem teilweisen Verlust von Vitamin D – jedoch nicht in dem Maße, wie es für die Verwendung als Kalibrator erforderlich wäre.
Schritt 2 – Entfernen der Kohle. Dem entfetteten Serum wird mit Dextran beschichtete Aktivkohle zugesetzt. Die Aktivkohle adsorbiert kleine hydrophobe Moleküle, darunter Vitamin-D-Metaboliten, Steroide, Schilddrüsenhormone und Fettsäuren. Die Aktivkohle wird durch Zentrifugation und Filtration entfernt, sodass ein Serum zurückbleibt, das frei von den Zielanalyten ist. Es können mehrere Aktivkohle-Behandlungszyklen durchgeführt werden, um einen Restgehalt an 25-OH-D von unter 4 ng/ml zu erreichen.
Schritt 3 – Sterile Filtration und Qualitätskontrolle. Das aufbereitete Serum wird bei 0,2 µm steril gefiltert und vor der Freigabe mittels Immunoassay und/oder LC-MS/MS auf 25-OH-D-Rückstände untersucht. Ein Virus-Screening (HIV-1/2, HBsAg, Anti-HCV, Syphilis) wird chargenweise durchgeführt.
Spezifikation für den 25-OH-D-Restwert – Welchen Wert benötigen Sie?
Die Standardspezifikation für HPS „Vitamin D-abgereichert“ ist ein Restgehalt an 25-OH-D von unter 4 ng/ml. Dies reicht für die meisten Anwendungen mit Immunoassay-Kalibratoren aus, bei denen der niedrigste Kalibrator im Kit in der Regel 10–15 ng/ml beträgt.
Bei LC-MS/MS-Methoden – bei denen die Nachweisgrenzen 1–2 ng/mL erreichen können – kann jedoch eine strengere Spezifikation für Restgehalte erforderlich sein. Einige Protokolle zur Methodenentwicklung schreiben einen 25-OH-D-Restgehalt von unter 2 ng/ml oder unter 1 ng/ml vor. Dies lässt sich durch zusätzliche Aktivkohlebehandlungszyklen erreichen, muss jedoch vor der Anwendung im jeweiligen Assaysystem bestätigt werden.
Wenn Sie HPS-Vitamin-D-Proben für LC-MS/MS-Anwendungen beziehen, fordern Sie chargenspezifische Analysedaten an, aus denen der Restgehalt an 25-OH-D hervorgeht, der mit derselben Methode gemessen wurde, die Sie für Ihren Assay verwenden werden – nicht nur Immunoassay-Ergebnisse, da diese möglicherweise keine Spurenrückstände nachweisen, die den massenspektrometrischen Nachweis beeinträchtigen könnten.
Worauf Sie bei der Beschaffung achten sollten – wichtige Parameter
Virus-Screening pro Charge. HPS Vitamin D depleted ist ein gepooltes Humanblutprodukt. Jede Charge muss einzeln auf HIV-1/2, HBsAg, Anti-HCV und Syphilis untersucht werden. Für die Herstellung nach IVD wird zunehmend ein NAT-Screening (HIV-1-RNA, HCV-RNA, HBV-DNA) verlangt – insbesondere für Produkte, die in die technischen Unterlagen nach IVDR aufgenommen werden. Klären Sie mit Ihrem Lieferanten, ob NAT standardmäßig durchgeführt wird oder auf Anfrage verfügbar ist.
Rückverfolgbarkeit der Spender. Die lückenlose Rückverfolgbarkeit der Spender muss dokumentiert sein – nicht nur Aufzeichnungen auf Pool-Ebene. Dies ist für die Dokumentation gemäß IVDR Anhang I sowie für die Einreichung technischer Unterlagen bei einer benannten Stelle erforderlich. Einige Lieferanten können keine individuelle Rückverfolgbarkeit der Spender für gepooltes Material gewährleisten – bitte vor der Bestellung überprüfen.
Chargenspezifische Analysedaten für CoA mit Vitamin D. Das Analysezertifikat muss den 25-OH-D-Restwert für diese spezifische Charge enthalten, nicht nur eine allgemeine Angabe. Schwankungen des Vitamin-D-Restgehalts von Charge zu Charge sind üblich – insbesondere bei Produkten, die ausschließlich einer Entfettung unterzogen wurden. Bestehen Sie auf chargenspezifischen Messdaten.
Mengen- und Chargenkonsistenz. Bei der IVD-Fertigung wird die Leistung des Kalibrators anhand einer bestimmten Matrixcharge validiert. Nach der Validierung erfordert ein Wechsel der Charge eine erneute Validierung – was kostspielig und zeitaufwendig ist. Suchen Sie nach Lieferanten, die eine Chargenreservierung (die Bereitstellung einer validierten Charge für Ihren Produktionszyklus) ohne Vorauszahlung anbieten.
Dokumentation zu IVDR. Die Anforderungen an die technischen Unterlagen für Rohstoffe gemäß Anhang II und Anhang III der Richtlinie IVDR umfassen: CoA, CoO, TSE/BSE-Erklärung, Aufzeichnungen zum Viren-Screening sowie Aufzeichnungen zum Spender-Screening. Für Hilfsstoffe kann ein ISO 13485-Herstellerzertifikat der Verarbeitungsanlage erforderlich sein. Bitte überprüfen Sie die Unterlagen vor der Bestellung von Produkten, die der IVDR-Verordnung unterliegen.
Plattformkompatibilität
HPS Vitamin D depleted ist mit allen gängigen automatisierten Immunoassay-Plattformen kompatibel, die für 25-OH-D-Tests verwendet werden:
- Roche Diagnostics — Elecsys-Gesamt-Vitamin-D-Test (Elektrochemilumineszenz)
- Abbott Diagnostics — Architect 25-OH-Vitamin D (CMIA)
- DiaSorin — LIAISON 25-OH-Vitamin D GESAMT (CLIA)
- Siemens Healthineers — ADVIA Centaur Vitamin D Gesamt
- Beckman Coulter — Vitamin D Total aufrufen
Bei LC-MS/MS-Methoden wird die von Lipiden befreite Serummatrix für die auf Proteinausfällung basierende Extraktion verwendet – die trübungsfreie, von Lipiden befreite Basis verhindert Artefakte durch Ionenunterdrückung, die bei nicht von Lipiden befreitem Serum auftreten würden.
Wie viel brauchst du?
Die Bestellmengen für HPS mit reduziertem Vitamin-D-Gehalt variieren je nach Anwendungsbereich erheblich:
Methodenentwicklung / Durchführbarkeit des Assays: 100–500 ml – ausreichend für die anfängliche Herstellung des Kalibrators und die Validierung der Zugabemenge und Wiederfindung.
Validierung des Assays (Leistungsstudie IVDR): 1–2 l – ausreichend für umfassende Untersuchungen der analytischen Leistungsfähigkeit, einschließlich Linearität, Präzision, Richtigkeit und Interferenzen.
Kommerzielle Fertigung von IVD-Bausätzen: 5–10+ Liter pro Produktionslauf – je nach Format des Kalibrierkits, Anzahl der Kalibrierstufen und Chargengröße. Bei Herstellern von Vitamin-D-Kits mit hohem Produktionsvolumen kann der Jahresbedarf 50–100+ Liter erreichen.
Bestellen Sie für die Fertigung stets mehr als Ihren unmittelbaren Bedarf – reservieren Sie eine vollständige Produktionscharge, um Chargenwechsel während des Programms und die damit verbundenen Kosten für die erneute Validierung zu vermeiden.
SeamlessBio – HPS-Vitamin-D-Mangel bei der Herstellung von IVD
EU-Lieferant · Passau, Deutschland · 100 ml bis über 10 Liter · Umfassendes Viren-Screening · Chargenspezifische CoA- und IVDR-Dokumentation · Chargenreservierung ohne Vorauszahlung · Kostenloses Testmuster · Angebotsantwort innerhalb von 48 Stunden
Literaturverzeichnis
Hollis BW. Die Bestimmung von 25-Hydroxyvitamin D im klinischen Umfeld: Herausforderungen und Anforderungen. Am J Clin Nutr. 2008;88(2):507S–510S.
Farrell CJL, Herrmann M. Bestimmung von Vitamin D und seinen Metaboliten. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2021;35(4):101488.
Cavalier E. et al. Externe Qualitätsprüfung von 25-Hydroxyvitamin D. Clin Chim Acta. 2014;431:60–65.
IVDR Verordnung (EU) 2017/746, Anhang I – Allgemeine Sicherheits- und Leistungsanforderungen.
SeamlessBio GmbH, Passau, Deutschland. Dieser Artikel dient ausschließlich wissenschaftlichen Informationszwecken. Für Produktspezifikationen und Informationen zur Verfügbarkeit wenden Sie sich bitte an info@seamlessbio.de.
English 
Deutsch